Меню Рубрики

Бланк исследование крови на малярию

3.2. ПРОФИЛАКТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Паразитологическая диагностика малярии

1. Методические указания подготовлены сотрудниками Института медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И.Марциновского Московской медицинской Академии им. И.М.Сеченова Минздрава России (к.м.н. Рабинович С.А., к.б.н. Кукина И.В., Mа. ская* Е.В., к.м.н. Морозов Е.Н.) и Федерального центра государственного санитарно-эпидемиологического надзора Минздрава России (к.б.н. Цыбина Т.Н., Сыскова Т.Г.).
________________
* Брак оригинала. — Примечание изготовителя базы данных.

2. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 19 октября 2000 г.

1. Область применения и нормативные ссылки

Паразитологическую лабораторную диагностику малярии проводят клинико-диагностические лаборатории лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) системы Минздрава, ведомственных учреждений, а также другие лаборатории, независимо от принадлежности и форм собственности (НИИ, вузов, Минобороны, УВД, частных клиник и т.д.), имеющие лицензию и аккредитованные в системе госстандарта и госсанэпиднадзора в установленном порядке.

Органы и учреждения государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации организуют и проводят эпидемиологический надзор за малярией, частью которого является:

контроль за уровнем лабораторной диагностики малярии в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений и других ведомств (в т.ч. исследования: 1) контрольные — не менее 10% препаратов крови, от числа отрицательных; 2) обязательные — 100% сомнительных и положительных препаратов крови с целью подтверждения лабораторного диагноза малярии);

обследование населения в очагах малярии, обследование населения по эпидпоказаниям и с консультативной целью.

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие нормативно-методические и правовые документы.

Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» (30 марта 1999, N 52-ФЗ).

«Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан» (22 июля 1993, N 5487-1).

Санитарные правила и нормы 3.2.569-96* «Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации».
_______________
* Действуют СанПиН 3.2.1333-03. — Примечание изготовителя базы данных.

Санитарные правила 3.1/3.2.558-96* «Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных заболеваний».
_______________
* Действуют СП 3.1/3.2.1379-03. — Примечание изготовителя базы данных.

Санитарные правила 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами 3-4 групп патогенности и гельминтами».

Возможность завоза малярии на территорию Российской Федерации, появление вторичных от завозных и местных случаев заболевания требуют своевременной лабораторной диагностики, необходимой для адекватного лечения и рационального проведения противоэпидемических мероприятий.

Малярию человека вызывают 4 вида паразитических простейших рода Plasmodium: Р. falciparum — возбудитель тропической малярии, Р. vivax — трехдневной малярии, Р. ovale — малярии типа трехдневной, Р. malariae — четырехдневной малярии. Неспецифические клинические проявления малярии, преимущественно в первые дни болезни, при наличии ряда объективных показателей эпидемиологического характера: географический анамнез (пребывание на территории стран с тропическим и субтропическим климатом) и клинического характера: лихорадочное состояние неясной этиологии, анемия, увеличение селезенки и ряд других — обязывают врачей лечебно-профилактических учреждений заподозрить малярию.

Безусловным подтверждением диагноза служит обнаружение малярийного паразита при микроскопическом исследовании крови. Особое значение имеет раннее выявление возбудителя тропической малярии, при несвоевременной диагностике которой возможен летальный исход. Определение вида паразита служит основанием для выбора рациональной терапии и правильной организации противоэпидемических мероприятий.

Проявления малярии обусловлены развитием паразита в эритроците — так называемой эритроцитарной шизогонией. В процессе эритроцитарной шизогонии образуются бесполые и половые формы паразита.

Бесполые формы за период времени, характерный для каждого вида паразита, проходят в эритроцитах ряд последовательных возрастных стадий своего развития, строение которых (морфология) и их окрашиваемость (тинкториальные свойства) хорошо различимы в «тонком мазке» крови. Трофозоиты — одноядерные растущие стадии: кольцевидные, развивающиеся (амебовидные, полувзрослые) и зрелые. Шизонты — делящиеся стадии: развивающиеся (незрелые), с последовательным делением ядер и общей цитоплазмой и зрелые, представляющие скопление дочерних клеток мерозоитов с обособленными ядрами и цитоплазмой. В динамике эритроцитарная шизогония в общем виде протекает следующим образом. Мерозоит, внедрившийся в эритроцит, быстро увеличивается в размере, в цитоплазме появляется пищеварительная вакуоль и образуется — кольцевидный трофозоит. На этой стадии цитоплазма имеет вид узкого ободка, огибающего пищеварительную вакуоль, ядро сравнительно мелкое, компактное с трудно различимой структурой хроматина, оттеснено к одному из полюсов клетки. По мере роста паразита увеличиваются его размеры, количество цитоплазмы нарастает: ядро становится более крупным, менее компактным. В цитоплазме могут появиться асимметричные утолщения, различающиеся по форме и числу, псевдоподии — образуется амебовидный трофозоит. В дальнейшем у развивающегося трофозоита постепенно исчезает вакуоль, продолжает увеличиваться ядро и количество цитоплазмы — образуется зрелый трофозоит. Зрелый трофозоит — округлая или несколько вытянутая клетка с относительно рыхлым ядром, правильной или несколько вытянутой формы, занимающая весь или часть пораженного эритроцита. Затем наступает стадия шизонта, начинается попарное деление ядер, образуется развивающийся (незрелый) шизонт. По окончании деления ядер одномоментно делится цитоплазма, обособляясь вокруг каждого из дочерних ядер — образуется зрелый шизонт, состоящий из мерозоитов; их число, размеры и расположение по отношению к скоплению пигмента характерны для каждого вида плазмодиев (см. таблицы). При отсутствии или неэффективном лечении мерозоиты внедряются в интактные эритроциты, и цикл вновь повторяется с присущей для каждого вида плазмодиев продолжительностью развития одной генерации. У Р. falciparum, P. vivax, P. ovale — 48 ч, Р. malariae — 72 ч.

В процессе роста паразита в его цитоплазме появляется малярийный пигмент — продукт метаболизма гемоглобина, представляющий собой включения от едва заметных мелких зерен и гранул до относительно более крупных, неправильной формы, от золотисто-коричневого до черного цвета. Количество пигмента, размеры его частиц и распределение в цитоплазме паразита меняются по мере его перехода в последовательные стадии развития.

У части трофозоитов деления ядер не происходит и они дифференцируются в половые формы, гаметоциты — женские (макрогаметоциты) и мужские (микрогаметоциты). Мужские и женские гаметоциты различаются между собой по морфологии, в первую очередь по структуре ядра, характеру и окраске цитоплазмы. В отличие от бесполых форм гаметоциты не имеют выраженной вакуоли, характеризуются значительно более обильным и грубым пигментом. Округлая форма присуща гаметоцитам Р. vivax, Р. ovale и Р. malariae, удлиненная серповидная (полулуния) — Р. falciparum. Гаметоцитов образуется меньше, чем бесполых форм. При этом женских гаметоцитов в 3-5 раз больше, чем мужских, что затрудняет выявление последних. Гаметоциты Р. vivax, Р. ovale, P. malariae значительно отличаются от гаметоцитов Р. falciparum по срокам созревания, появления в периферической крови и сохранения способности заражать переносчика (самок комара Р. anopheles).

Р. vivax, Р. ovale и Р. malariae развиваются в эритроцитах, циркулирующих в периферической крови. Развитие Р. falciparum происходит в синусах селезенки и мелких капиллярах внутренних органов в связи с адгезией пораженных эритроцитов к стенкам таких капилляров. В периферической крови обнаруживаются, преимущественно при неосложненном течении, только самые молодые стадии — кольцевидные трофозоиты. Их число очень быстро нарастает, поэтому при однократном исследовании периферической крови в начале болезни можно получить неправильное представление об истинном числе паразитов. При осложненном течении в периферической крови могут быть обнаружены более зрелые возрастные стадии паразита и гаметоциты в связи с нарушением сосудистого тонуса.

При оценке результатов исследования препаратов крови, наряду с типичной морфологией возбудителя, необходимо учитывать ряд особенностей, характеризующих паразитологическое развитие инфекции собственно и привходящих воздействий (предшествовавшее применение противомалярийных препаратов, неправильное приготовление и окраска препаратов крови).

Паразитологическая диагностика малярии основана на обнаружении бесполых и половых форм возбудителя при микроскопическом исследовании крови, что возможно только в период его развития в эритроците. Для обнаружения плазмодиев и определения их вида используют препараты крови, приготовленные методом «тонкого мазка» и «толстой капли», окрашенные по Романовскому-Гимза. Оба метода, имеющие свои преимущества и недостатки, являются взаимодополняющими.

Основной метод — «толстая капля». Благодаря распределению относительно большего объема крови на меньшей площади, за один и тот же промежуток времени просматривается количество крови в 30-40 раз большее, чем в «тонком мазке», что значительно повышает шанс обнаружения паразитов, особенно при низкой паразитемии. Начинать надо всегда с просмотра «толстой капли».

Чувствительность метода «толстой капли» такова, что при просмотре 100-150 полей зрения можно обнаружить около 8 паразитов в 1 мкл крови. Концентрация исследуемой крови на ограниченной площади приводит к многослойному расположению эритроцитов. Для того чтобы паразиты были видимы, «толстую каплю» окрашивают нефиксированной; это приводит к гемолизу эритроцитов, и паразиты подвергаются деформации. Несмотря на определенную специфичность, такая деформация иногда может препятствовать идентификации вида паразита. Ограничиться просмотром «толстой капли» можно только, если вид паразита был первоначально установлен. «Толстая капля» относительно быстро позволяет выявить и других паразитов крови: трипаносом, микрофилярий, спирохет, бабезий и др. Отрицательный паразитологический результат изучения «толстой капли», но повышенное содержание остатков незрелых эритроцитов позволяет предположить перенесенную недавно малярию (при отсутствии соответствующих анамнестических данных), обнаружение повышенного содержания лейкоцитов, их видовой состав, а также повышенное содержание остатков незрелых эритроцитов, позволяют предположить иное заболевание, не связанное с малярией.

В «тонком мазке», фиксированном до окраски, сохраняются морфологические особенности как пораженного эритроцита, так и присущие данному виду паразита. Большое значение для дифференциального диагноза имеет характер изменения пораженных эритроцитов. «Тонкий мазок» крови делают в дополнение к «толстой капле». В тех случаях, когда вид возбудителя в очаге установлен, для эпиднадзора за очагом можно ограничиться методом «толстой капли».

2. Азур-эозин по Романовскому-Гимза (промышленный маточный раствор или сухая краска).

7. Калий фосфат однозамещенный безводный — KH PO .

источник

Купить МУК 4.2.3222-14 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО «ЦНТИ Нормоконтроль»

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Методические указания регулируют порядок применения метода отбора проб и методов лабораторных исследований биологического материала людей с целью обнаружения возбудителей малярии и бабезиозов, определения их видовой принадлежности, и носят рекомендательный характер. Методические указания предназначены для специалистов паразитологических, микробиологических лабораторий Роспотребнадзора, медицинских организаций, индивидуальных предпринимателей, а также научно-исследовательских институтов, осуществляющих лабораторную диагностику малярии и бабезиозов.

3. Методы лабораторной диагностики малярии и бабезиозов

4. Техника паразитологической (микроскопической) диагностики малярии и бабезиозов

4.1. Подготовка предметных стекол

4.2. Приготовление и хранение реактивов

4.3. Взятие проб крови для исследования на малярию

4.4. Приготовление препаратов крови, их маркировка и фиксация

4.5. Окраска препаратов крови

4.6. Микроскопия окрашенных препаратов крови

5. Микроскопическая диагностика возбудителей малярии и бабезиозов

5.1. Морфологические признаки возбудителей малярии

5.2. Алгоритм просмотра препаратов крови на малярию

5.3. Изменения морфологии паразита и пораженных эритроцитов, возникающие в процессе приготовления и окраски препаратов крови

5.4. Изменения морфологии паразита, связанные с воздействием химиотерапевтических препаратов

5.5. Источники диагностических ошибок

5.6. Оценка интенсивности паразитемии

5.7. Учет результатов исследования и оформление ответа

5.8. Порядок исследования препаратов крови, контроля и направления результатов на подтверждение

5.9. Паразитологический контроль за эффективностью лечения

5.10. Морфологические признаки возбудителей бабезиозов

6. Иммунохроматография в лабораторной диагностике (экспресс-тесты).

7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Приложение 1. Необходимые реактивы и оборудование

Приложение 2. Возбудители паразитозов под воздействием противомалярийных препаратов в тонких мазках и толстых каплях

Приложение 3. Элементы крови, контаминанты и образования, симулирующие малярийных паразитов

Приложение 4. Приготовление толстой капли на плёнке для создания учебных коллекций по А. Е. Беляеву (1981)

22.09.2014 Утвержден Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
Издан Роспотребнадзор 2015 г.
Разработан Инфекционная клиническая больница № 2 города Москвы
Разработан ГБОУ ДПО РМАПО
Разработан Научно-исследовательский институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского
Разработан ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова
Разработан ГБОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Минздрава России
Разработан ФБУЗ Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора
Разработан Управление Роспотребнадзора по г. Москве
Разработан Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методические указания МУК 4.2.3222-14

Л12 Лабораторная диагностика малярии и бабезиозов: Методические указания.—М.: ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора,— 43 с.

1. Разработаны Научно-исследовательским институтом медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е. И. Марциновского ГБОУ ВПО Первого Московского государственного медицинского университета (МГМУ) им. И. М. Сеченова (В. П. Сергиев. С. А. Рабинович. Е. Н. Морозов. Е. В. Максаковская. М. Н. Лебедева): кафедрой тропической медицины и паразитарных болезней МПФ Первого Московского государственного медицинского университета им. И. М. Сеченова (И. В. Кукина. Л. Ф. Морозова): Федеральной службой по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (Т. М. Гузеева): ГБОУ ДПО -Российская медицинская академия последипломного образования» Мин права России (М. С. Орлов); ФБУЗ -Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (Т. Г. Сыскова): ГБОУ ДПО РМАПО (А. Е. Беляев. Ю. П. Горбунова); Управлением Роспотребнадзора nor. Москве(Т. Н. Иванова); ФБУЗ-Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве» (Н. И. Тимошенко): Инфекционной клинической больницей № 2 г. Москвы (В. Д. Сады ко ва).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 26 июня 2014 г. № 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 22 сентября 2014 г.

4. Разработаны взамен МУК 3.2.987—00 «Паразитологическая диагностика малярии».

© Федеральный центр гигиены

и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2015

4.5.1. Приготовление рабочего раствора краски Романовского—Гимзы

Оптимальную концентрацию рабочего раствора и время окрашивания нужно подобрать самостоятельно, так как они зависят от качества маточного раствора краски и от температуры окружающей среды.

1. Маточный раствор краски Романовского—Гимзы (промышленного изготовления или приготовленный из сухой смеси) перемешать и обязательно профильтровать.

2. Непосредственно перед употреблением приготовить 5% (10%) рабочий раствор краски: к 95 (90) мл буферного раствора добавить 5 (10) мл маточного раствора краски (соответствует 1—2 каплям краски на 1 мл раствора).

3. Готовый рабочий раствор перемешать.

4. При необходимости ускорения получения ответа можно использовать 20 % раствор, сократив время окраски до 15—20 мин.

Рабочий раствор краски Романовского-Гимзы для окрашивания препаратов крови использовать в течение 1 ч!

Для определения качества маточного раствора краски Романовского-Гимзы каждой новой серии производят пробное окрашивание препаратов крови.

Показатели качественного окрашивания. Правильно окрашенный препарат макроскопически имеет синий цвет с сиреневым оттенком, а при его микроско-пировании:

— ядра лейкоцитов фиолетового цвета с различной структурой хроматина;

— зернистость базофилов фиолетового цвета;

— зернистость эозинофилов оранжево-красного цвета;

— у моноцитов на фоне серо-голубой цитоплазмы может быть вишневокрасная зернистость;

— зрелые эритроциты — розового цвета с сероватым оттенком;

— тромбоциты — сиренево-розового цвета с ра зличимой сетчатостью.

Иногда в промышленных сериях маточного раствора краски Романовского-

Гимзы недостаточно а зура, что обусловливает слабое окрашивание азурофильных элементов (ядер малярийных паразитов, зернистости пораженных эритроцитов и лейкоцитов). Результаты окрашивания мазков и капель могут быть значительно улучшены при добавлении к рабочему раствору краски Романовского так называемой синьки Мэнсона, которую готовят заранее следующим образом: 1,5 г метиленового синего и 2.5 г буры растирают в ступке и добавляют к 100 мл дистиллированной воды. Для созревания флакон с краской оставляют на 10—12 дней при комнатной температуре. Процесс созревания можно ускорить, поместив флакон на водяную баню на 40—60 мин при 60—80 *С.

Синька Мэнсона при хранении в темном сухом месте пригодна к использованию в течение многих лет. Количество краски Мэнсона. добавляемое к рабочему раствору краски Романовского-Гимзы, устанавливают опытным путем: нередко достаточно добавить к 1 л рабочего раствора несколько капель краски.

4.5.2. Способы окрашивания и промывки тонкого мазка и толстой капли по Романовскому—Гимзе

Окрашивание препаратов крови, в зависимости от их количества, можно проводить двумя способами:

1. Препараты крови вертикально помешают в специальные ванночки или контейнеры, без соприкосновения друг с другом. Затем наливают рабочий раствор краски. Данный способ окраски наиболее приемлем, когда есть необходимость окраски большого количества препаратов крови. В стандартном контей-

нере можно окрасить 20 препаратов при вместимости 90 мл краски. Повторно использовать краску нельзя.

2. Препараты располагают горизонтально (мазками вверх) на рельсах, лежащих на кюветах. Осторожно наносят краску. Этот способ окраски чаще применяют при окрашивании небольшого количества препаратов крови. Расход рабочего раствора краски составляет примерно 4 мл на I препарат. Вместе с тем. при таком способе есть риск выпадения осадка, что может затруднить микроскопию.

Время окрашивания зависит от температуры окружающей среды и концентрации рабочего раствора краски. Так. например, при температуре 20—23 в С тонкий мазок окрашивают 40—50 мин, толстую каплю — 20—25 мин 10 %-м раствором краски. При менее высокой температуре время окрашивания увеличивают. При очень высокой температуре (около 30 °С) время окрашивания капель, но не мазков. может быть сокращено до 15 мин. Толстые капли, предварительно обработанные забуференным раствором метиленового синего, окрашивают 6—10 мин.

Препараты крови на малярию окрашивают и исследуют немедленно после взятия в режиме «ОТО!*

Промывку тонких мазков, фиксированных до окраски, проводят под струей проточной воды из пипетки или погружением в емкость.

При промывке толстых капель необходима осторожность, так как капли могут оторваться от стекла. Кроме того, на поверхности раствора образуется оксидная плёнка, которая при сливании краски неизбежно останется на препарате. По этой причине необходимо не выливать краску из контейнера, но вытеснять её. подставив контейнер под слабую струю воды. При окраске на рельсах препарат, не сливая краску, медленным движением погружают в емкость с чистой водой 1—2 раза и высушивают в вертикальном положении.

Читайте также:  Малярия во вьетнаме 2017

4.6. Микроскопия окрашенных препаратов крови

Препараты крови исследуют под микроскопом с применением масляной иммерсии: объектив х90 или х100, окуляр х7, х8 или х10. с поднятым конденсором и полностью открытой диафрагмой.

С диагностической целью сначала ми крое копируют толстую каплю, затем, при необходимости, для уточнения вида возбудителя — тонкий мазок.

Правильно приготовленная и окрашенная толстая капля должна иметь светлый фон без нитей фибрина и осадка краски.

При нормальной толщине капли в каждом поле зрения должно быть 10—15 лейкоцитов. Обязательно нужно просмотреть краевую зону, более тонкую часть толстой капли, где эритроциты не полностью гемолизированы и может сохраниться неизмененная морфология паразита и пораженного эритроцита, что облегчит дифференциальный диагноз. Если вероятность малярии у пациента велика, а паразиты не выявляются, повысить эффективность выявления паразитов лучше просмотрев вторую каплю, а не увеличивая время просмотра той же самой капли. Унифицировать время просмотра толстой капли невозможно, так как оно зависит от опыта микроскоп иста, качества препарата и др.

Препарат считается отрицательным, если паразиты не обнаружены после просмотра 100 полей зрения толстой капли. 0|рицагелы1ый диагноз не может считаться достоверным, если исследован только тонкий мазок.

При отрицательном первичном результате, но высокой вероятности (анамнестических, эпидемиологических, клинических показаниях) наличия малярии у пациента кровь исследуют повторно через 6—12—24 ч. При плохом качестве приготовления толстой капли исследование крови повторить немедленно.

После первого обнаружения паразитов исследование продолжают для того чтобы:

— определить видовую принадлежность паразитов;

— указать, какие стадии паразитов найдены (только в случае Р. falciparum);

— указать наличие или отсутствие гаметоцитов в случае тропической малярии;

— указать количество паразитов, руководствуясь одним из предлагаемых ниже методов;

— не пропустить смешанную инфекцию.

В тонком мазке для обнаружения малярийных паразитов исследуют участок, где эритроциты расположены в один слой — бахромчатую и прилегающую к ней зону — так называемый хвост препарата.

При просмотре тонкого мазка используется метод «зубчатая стена»: просмотр края мазка последовательными вертикально-горизонтальными передвижениями препарата.

Определение вида основано на совокупности ряда признаков как самого паразита. так и пораженного эритроцита.

5.1. Морфологические признаки возбудителей малярии

Последовательность установления диагноза при малярии следующая:

— решается вопрос, есть ли паразиты;

— решается вопрос, не Р. falciparum ли это;

— находят характерные стадии, позволяющие дифференцировать три остальных вида;

— если установлено, что речь идёт о Р. falciparum. решают, присутствуют ли гаметоциты.

Кольцевидные и амебовидные трофозоиты

Кольца обычно немногочисленны. крупнее, чем у Р.falciparum.

Общая характеристика. Продолжительность эритроцитарной шизогонии — 48 ч. В периферической крови могут быть обнаружены все формы эритроцитарной шизогонии. Интенсивность паразитемии редко превышает 20 тыс. паразитов в 1 мкл крови. При нарастании паразитемии синхронность утрачивается, характерен полиморфизм — одновременное наличие разных возрастных стадий бесполых форм паразита и гаметоцитов. Встречается поражение одного эритроцита несколькими паразитами, но реже и в меньшей степени, чем в случае Р. falciparum. Пораженные эритроциты увеличиваются тем больше, чем старше паразит, иногда в 1.5 раза. По мере развития паразита эритроцит обесцвечивается, иногда приобретает неправильную форму, на поверхности эритроцита появляется мелкая, обильная, неравномерная азурофильная зернистость, так называемая зернистость Шюффнсра.

Мерозоиты. внедрившиеся в эритроциты. преимущественно в незрелые, превращаются в юные кольцевидные грофозоиты.

Более юные занимают !/б пораженного эритроцита, более взрослые — У4- Ядро округлое, реже несколько вытянутое, относительно плотное. Вакуоль хорошо выражена. В цитоплазме у растущих колец нередко появляются утолщения в одном из участков. Пигмент — отдельные нежные мелкие зерна, темно-коричневые.

У наиболее молодых ядро и цитоплазма резко уплотняются; цитоплазма в виде комочка, иногда несколько изогнутой формы, напоминает в сочетании с ядром «запятую». У несколько более крупных колец цитоплазма разрывается на удлиненные полоски, которые в сочетании с ядром могут напоминать «восклицательный знак», «ласточку». При обнаружении в препарате только единичных юных колец определение вида паразита затруднено.

Амебовидные трофозоиты. Цитоплазма разорвана на фрагменты разного размера, располагающиеся вблизи ядра. Редко сохраняется вакуоль.

Состояние пораженных эритроцитов. Остатки пораженных эритроцитов могут сохраняться в виде розового ореола, иногда с различимой зернистостью Шюффнера, на периферии капли или на тонком мазке крови при приготовлении толстой капли на тонком мазке. Это так называемые тени, выраженность которых зависит от достаточного содержания азура в краске.

Амебовидные трофозоиты занимают 1/з— 1/2 эритроцита, более зрелые — его значительную часть. Ядро круглое или овальное, крупнее и менее плотное в сравнении с кольцевидными трофозоитами, расположено периферически. Цитоплазма разнообразной формы с псевдоподиями, отражающими присущую этим стадиям амебоидную активность — это определило название вида паразита (viva означает живой, подвижный). Наиболее молодые имеют несколько длинных тонких псевдоподий, количественно увеличивающихся по мере роста, придавая паразиту причудливую форму. Пигмент — отдельные нежные зерна темно-коричневого цвета, в разных участках цитоплазмы. Вакуоль относительно крупная, встречается так называемая добавочная вакуоль — артефакт, результат слияния концов двух псевдоподий при приготовлении и последующей фиксации мазка крови. Пигмент темно-коричневый. расположен чаще диффузно в цитоплазме, иногда концентрируется вокруг вакуоли или по периферии паразита. По мере роста паразита вакуоль постепенно уменьшается, псевдоподии сглаживаются.

Развивающиеся и зрелые трофозоиты

В толстой капле развивающиеся трофозоиты разнообразной фор-

Состояние пораженных эритроцитов. На стадии юных колец эритроцит почти не увеличен, появляются мелкие, едва различимые единичные зерна Шюффнера. На стадии более молодых амебовидных трофозоитов размеры эритроцита и интенсивность зернистости Шюффнера нарастают.

Развивающиеся трофозоиты. Утрачивают псевдоподии, округляются, уменьшается размер вакуоли, увеличивается масса ядра и

цитоплазмы. Пигмент становится более выраженным и обильным.

Зрелыетрофозоиты. Занимают значительную часть сильно увеличенного эритроцита, форма округлая или овальная без псевдоподий и вакуоли. Ядро относительно крупное, рыхлое, чаше несколько вытянутое, иногда дугообразное. Цитоплазма занимает основную часть эритроцита. Пигмент хорошо выражен, расположен диффузно или концентрируется по периферии паразита, может группироваться в отдельные скопления.

Состояние пораженных эритроцитов. На стадии развивающихся и зрелого трофозои-та увеличение эритроцита достигает максимального размера с четко рахпичимой зернистостью Шюффнера.

мы и размера. Цитоплазма обычно разорвана, в зависимости от возраста паразита около ядра концентрируются 2 и более фрагментов цитоплазмы. Иногда сохраняется большая вакуоль. Зрелые трофозоиты сохраняют особенности морфологии тонкого мазка, но резко сжимаются.

Состояние пораженных эритроцитов. Остатки пораженных эритроцитов могут сохраняться в виде розового ореола (см. выше, кольцевидные и амебовидные трофозоиты. толстая капля).

Развивающиеся (незрелые) шизонты

Развивающиеся шизонты округлой или овальной формы, без вакуоли и псевдоподий занимают значительную часть эритроцита. В неразделившейся цитоплазме от 2 ядер, уменьшающихся в размере и увеличивающихся в количестве по мере их деления. Пигмент начинает концентрироваться в отдельные скопления.

Состояние пораженных эритроцитов. Максимально выражено увеличение пораженного эритроцита и интенсивность зернистости Шюффнера.

Нашивающиеся шизонты. Сохраняют особенности морфологии «тонкого мазка», но сжимаются.

Состояние пораженных эритроцитов. Остатки пораженных эритроцитов могут сохраняться в виде розового ореола (см. выше, кольцевидные и амебовидные трофозоиты, толстая капля).

Зрелые шизонты. Занимают почти весь или весь эритроцит. Содержат 14—18 (в среднем 16) относительно мелких мерозои-тов, расположенных асимметрично по отношению к пигменту, собранному в одно плотное скопление. Мерозоит конической

Зрелые шизонты. Сохраняют особенности морфологии тонкого мазка, но сжимаются.

Состояние пораженных эритроцитов. Остатки пораженных эритроцитов могут сохраняться в

или овальной формы не свыше 2 мкм в диаметре, ядро мелкое и плотное, расположено апикально.

виде розового ореола (см. выше, кольцевидные и амебовидные трофозоиты, толстая капля)

Сегментоядерный лейкоцит и тромбоциты представлены для сопоставления масштаба.

Состояние пораженных эритроцитов. К моменту образования мерозоитов. пораженный эритроцит разрывается, в отдельных случаях может еше сохраняться с видимой зернистостью Шюффнера.

Женские гаметоциты округлые, компактные, не всегда отличимы от зрелых трофозоитов.

Мужские гаметоциты легко распознаются в результате особенности их деформации в толстой капле. Ядро уплотняется и превращается в относительно крупное округлое образование. Цитоплазма также уплотняется и как «венчик» окружает ядро. На фоне цитоплазмы четко выявляются многочисленные зерна пигмента.

Состояние пораженных эритроцитов. Остатки пораженных эритроцитов могут сохраняться в виде розового ореола (см. выше, кольцевидные и амебовидные трофозоиты, толстая капля).

Женские гаметоциты. Округлые или овальные занимают весь пораженный эритроцит. Ядро относительно плотное, округлое или вытянутое, расположено асимметрично, реже в центре клетки. Размер ядра варьирует. Периферия ядра иногда окрашена менее интенсивно, создавая «зону просветления».

Цитоплазма окрашена в более интенсивный сине-голубой цвет в сравнении с бесполыми формами, вакуоли нет. Пигмент — обильный, мелкие интенсивно окрашенные гранулы или грубые зерна, рассеянные по цитоплазме, имеющие более коричневый оттенок в сравнении со зрелыми трофозоитами. Женские гаметоциты иногда трудно дифференцировать со зрелыми трофозоитами.

Мужские гаметоциты. Несколько уступают в размерах женским гаметоцитам. Ядро крупное, рыхлое с просветлениями, без четких границ, диффузное, иногда различимо с трудом. Имеет более светлую или яркую окраску в сравнении с женским гаметоци-том. Иногда на фоне ядра обнаруживаются отдельные скопления хроматина, имеющие более интенсивную окраску. Цитоплазма с розовым оттенком. Пигмент — мелкие обильные гранулы или грубые зерна яркой коричневой окраски, рассеяны по цитоплазме с тенденцией к концентрации вокруг ядра.

Состояние пораженных эритроцитов.

Эритроцит увеличен, по периферии паразита видна зернистость Шюффнера.

Общая характеристика. Продолжительность эритроцитарной шизогонии — 48 ч. При неосложненном течении в периферической крови обнаруживаются

3. Методы лабораторной диагностики малярии и бабезиозов. 5

4. Техника паразитологической (микроскопической) диагностики

4.1. Подготовка предметных стекол . 5

4.2. Приготовление и хранение реактивов. 6

4.3. Взятие проб крови для исследования на малярию. 7

4.4. Приготовление препаратов крови, их маркировка и фиксация. 7

4.5. Окраска препаратов крови. 10

4.6. Микроскопия окрашенных препаратов крови. 12

5. Микроскопическая диагностика возбудителей мазярии и бабезиозов. 13

5.1. Морфологические признаки возбудителей малярии. 13

5.2. Алгоритм просмотра препаратов крови на малярию. 24

5.3. Изменения морфологии паразита и пораженных эритроцитов,

возникающие в процессе приготовления и окраски препаратов крови. 25

5.4. Изменения морфологии паразита, связанные с воздействием

химиотерапевтических препаратов. 25

5.5. Источники диагностических ошибок. 26

5.6. Оценка интенсивности паразитемии. 26

5.7. Учет результатов исследования и оформление ответа. 28

5.8. Порядок исследования препаратов крови, контроля

и направления результатов на подтверждение. 29

5.9. Паразитологический контроль за эффективностью лечения. 31

5.10. Морфологические признаки возбудителей бабезиозов. 32

6. Иммунохроматография в лабораторной диагностике (экспресс-тесты). 34

7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). 35

npiuoxcemie I. Необходимые реактивы и оборудование. 37

Прнюжение 2. Возбудители паразитозов под воздействием

противомалярийных препаратов в тонких мазках и толстых каплях. 38

Прнюжение 3. Элементы крови, контаминанты и образования.

симулирующие малярийных паразитов. 41

Пртожение 4. Приготовление толстой капли на плёнке

для создания учебных коллекций по А. Е. Беляеву (1981). 42

Руководитель Федератьной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методические у казания МУК 4.2.3222-14

1. Методические указания (далее — МУК) регулируют порядок применения метода отбора проб и методов лабораторных исследований биологического материала людей с целью обнаружения возбудителей малярии и бабезиозов, определения их видовой принадлежности, и носят рекомендательный характер.

2. Методические указания предназначены для специалистов паразитологических, микробиологических лабораторий Роспотребнадзора, медицинских организаций. индивидуальных предпринимателей, а также научно-исследовательских институтов, осуществляющих лабораторную диагностику малярии и бабезиозов.

Возможность завоза малярии на территорию Российской Федерации, появление вторичных от завозных, а также местных случаев заболевания требует своевременной лабораторной диагностики, необходимой для лечения и рационального проведения противоэпидемических мероприятий.

Неспецифические клинические проявления малярии, преимущественно в первые дни болезни, при наличии ряда объективных показателей эпидемиологического характера (географический анамнез — пребывание на территории стран с тропическим и субтропическим климатом) и клинического характера (лихорадочное состояние неясной этиологии, анемия, увеличение селезенки) обязывают врачей лечебно-профилактических организаций заподозрить малярию. Безусловным подтверждением диагноза служит обнаружение малярийного паразита при микроскопическом исследовании крови. Особое значение имеет раннее выявление возбудителя тропической малярии, при несвоевременной диагностике которой возможен летальный исход. Определение вида паразита служит основанием для выбора рациональной терапии и правильной организации противоэпидемических мероприятий.

Диагностика возбудителей бабезиозов вводится в целях дифференциальной диагностики с возбудителями малярии, в частности, с Р. falciparum. Поскольку, несмотря на различия в жизненном цикле возбудителей малярии и бабезиозов. они имеют ряд близких особенностей по морфологии некоторых стадий развития возбудителей в эритроцитах и по клиническим проявлениям инфекции. Ошибочная диагностика может привести к летальному исходу.

3. Методы лабораторной диагностики малярии и бабезиозов

Диагностика малярии основана на обнаружении кровяных форм паразитов (трофозоиты, шизонты и гаметоциты) при микроскопическом исследовании крови. В настоящее время не предложено способов обнаружения гипнозоитов: ни иммунологических, ни паразитологических. Для обнаружения эритроцитарных форм плазмодиев и определения их вида используют препараты крови, приготовленные методом тонкого мазка и толстой капли, окрашенные по методу Романовского-Гимзы. Оба метода, имеющие свои преимущества и недостатки, являются взаимодополняющими.

Основной метод — толстая капля. В толстой капле форменные элементы располагаются многослойно. В результате за один и тот же промежуток времени просматривается количество крови в 30—40 раз большее, чем в тонком мазке, что значительно повышает шанс обнаружения паразитов, особенно при низкой пара-зитемии. Чувствительность метода толстой капли такова, что при просмотре 100 полей зрения можно обнаружить паразитов при их численности около 8 в 1 мкл крови. Начинать надо всегда с просмотра толстой капли.

Толстую каплю окрашивают нефиксированной; это приводит к гемолизу эритроцитов, в результате чего паразиты становятся доступными для выявления. Однако при этом паразиты подвергаются деформации.

Толстая капля может позволить выявить и других паразитов крови: бабезий. трипаносом, микрофилярий. спирохет. В тонком мазке, фиксированном до окраски. сохраняются морфологические особенности, присущие данному виду паразита, и характерные изменения пораженного эритроцита. Тонкий мазок крови делают в дополнение к толстой капле.

Дифференциальное определение вида малярийного паразита проводят по совокупности признаков: морфологии паразита, состоянию пораженных эритроцитов, соотношению стадий паразита, обнаруженных в периферической крови.

Кроме того, в настоящее время широко используются для лабораторной диагностики малярии иммунологические (экспресс-тесты) и молекулярно-биологические методы. Данные методы являются взаимодополняющими, но «золотым» стандартом остается метод микроскопии толстой капли.

Основным методом диагностики бабезиозов является микроскопическое исследование препаратов крови — толстой капли и тонкого мазка. Однако при диагностике инфекции В. microti, характеризующейся низкой или субмикроскопической паразитемией, одна микроскопия при отрицательном результате может создать ложное представление, поэтому применяют и другие методы. Проводится иммунологическое исследование для обнаружения специфических антител с применением иммунофлюоресцентной методики (РИФ), а также молекулярнобиологическим методом — полимеразной цепной реакцией (ПЦР), позволяющей выявить единичные особи паразита. Для выявления низкой и субмикроскопической паразитемии проводится заражение хомяков кровью больного — изодиагностика; заболевание хомяков наступает спустя 1—4 недели.

4. Техника паразитологической (микроскопической) диагностики малярии и бабезиозов

4.1. Подготовка предметных стекол

Стекла, многократно бывшие в употреблении, для приготовления препаратов крови использовать запрещается, так как имеющиеся на них царапины могут затруднить диагностику и даже привести к диагностическим ошибкам.

Следует пользоваться только новыми стёклами и. предпочтительно, очищенными при изготовлении (precleaned) и готовыми к употреблению.

Использование новых стекол рентабельнее, так как устраняется трудоёмкий ручной процесс и гарантируется качество.

Если новые стёкла поставлены неочищенными, то их очищают следующим образом:

1. Новые предметные стекла замачивают в мыльном растворе, нагретом до 60 в С, не кипятят.

2. Каждое предметное стекло протирают ветошью с обеих сторон в этом растворе.

3. Промывают в проточной воде в течение 2—Зч, периодически перемешивая.

4. Погружают в дистиллированную воду на 30 мин; при отсутствии возможности протереть стекла в тот же день, их оставляют в холодильнике в дистиллированной воде до следующего дня.

5. Качество отмывки предметных стекол от щелочи проверяют нанесением на предметное стекло 1 капли фенолфталеина — появление розовой окраски раствора свидетельствует о недостаточной отмывке от щелочи.

6. Стекла вытирают чистой хлопчато-бумажной тканью и помещают для обезжиривания в смесь Никифорова (из расчета 1 мл смеси на 1 стекло) или спирт 70% где они могут храниться в течение длительного времени.

7. Извлеченные пинцетом из смеси Никифорова стекла протирают хлопчатобумажной материей, заворачивают в чистую гладкую не ворсистую бумагу небольшими партиями, оптимально по 6 штук — на одного больного.

Во время манипуляций с чистыми предметными стеклами их следует брать только за боковые поверхности или пинцетом.

4.2. Приготовление и хранение реактивов

4.2.1. Раствор краски Романовского-Гимзы

Маточный раствор краски Романовского-Гимзы представляет собой густую темно-фиолетовую жидкость, которую можно хранить в течение срока годности в сухом, защищенном от света, прохладном месте (но не в холодильнике). Для определения качества маточного раствора краски Романовского каждой новой серии производят пробное окрашивание препаратов крови.

Рабочий раствор краски Романовского готовят непосредственно перед употреблением из маточного раствора. Рабочий раствор должен быть использован в течение 1 ч, хранить его нельзя. Для текущей работы перед приготовлением рабочего раствора краски Романовского-Гимзы необходимое количество маточного раствора краски отливают в небольшой флакон, обязательно фильтруя через бумажные фильтры, так как при хранении маточного раствора может выпасть осадок. Этот раствор безводный и портится от попадания воды, поэтому не следует отбирать его пипеткой из-за риска контаминации водой, а следует отливать через горлышко.

1. Дистиллированная вода — 1 л.

2. Фосфат калия однозамещенный безводный — КН2Р04 — 0,27 г.

3. Фосфат натрия двузамещенный безводный — Na2HP04 — 0,67 г.

1. Соли растворить в дистиллированной воде (*/з объема) комнатной температуры, после полного растворения довести до метки 1,0 л.

2. Приготовленный раствор должен иметь pH (7.0 ± 0.2). Точное соблюдение требуемой реакции буфера важно для правильной окраски. Если pH 7.2. то добавляется КН2Р04. Количество реактивов. необходимых для доведения pH. подбирают опытным путем.

Читайте также:  Малярия во рту лечение

Лучше использовать готовые таблетки фосфатного буфера (диапазон pH 7.0— 7,2).

Буферный раствор следует хранить в хорошо закупоренной посуде в холодильнике (до 1 месяца). Нельзя использовать старый буферный раствор с осадком или зазеленевший от развития водорослей. При искажении цвета окрашенных элементов крови следует проверить pH буферного раствора.

4.3. Взятие проб крови для исследования на малярию

1. Кровь для паразитологического исследования берут из пальца руки (у взрослых — обычно безымянного, у детей — из большого), у новорождённых детей — из большого пальца ноги (но не мочки уха!). Использовать венозную кровь можно только в случаях, если известно, что в качестве антикоагулянта применяли ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), другие антикоагулянты, такие как гепарин, цитрат, не должны быть использованы, так как они могут влиять на морфологию паразитов.

2. Периферическую кровь для исследования берут вне зависимости от температуры тела и клинических проявлений. Распространено неверное мнение, что для обнаружения малярийных паразитов кровь у больного следует брать на высоте приступа.

3. Для прокола кожи пальца используют стерильные одноразовые скарификаторы или специальные стерильные разового использования иглы.

4. Перед проколом кожу пальца тщательно протирают ватным тампоном, смоченным в 70 %-м спирте, чем достигается не только предупреждение инфицирования места прокола, но и попадание с кожи пальца бактерий, различных посторонних частиц на препарат крови, которые могут затруднить диагностику при микроскопии.

5. Первую каплю крови, выступившую после прокола, вытирают сухим стерильным ватным тампоном, чтобы и збежать фиксации эритроцитов остатками спирта, которым дезинфицировали кожу.

6. Последующие капли (выступающие самостоятельно или при легком надавливании на палеи массирующими движениями) используются для приготовления препаратов крови. Кровь набирают в стерильный сухой гематологический капилляр, из которого быстро переносят на предметное стекло, либо выступившую кровь непосредственно из прокола пальца наносят на предметные стекла.

7. От одного пациента готовят не менее 3 стекол с толстыми каплями и 3 тонких мазка крови. Рекомендуется первоначально окрасить по одному стеклу, чтобы иметь возможность исправить дефекты окраски.

4.4. Приготовление препаратов крови, их маркировка и фиксация

4.4.1. Препарат толстая катя

Препарат толстая капля готовится следующим образом:

— на предметное стекло наносят 2 капли крови диаметром около 5 мм, кровь распределяют в равномерные диски диаметром 1,0—1,5 см с помощью угла чистого стекла или в прямоугольники с помощью скарификатора, которым прокалывали кожу;

— между каплями делается мазок в виде полоски дзя маркировки препарата отдельного пациента, при массовых обследованиях делаются две полоски: на одной полоске указывается Ф.. И.. О. и дата взятия крови, на другой — название лечебно-профилактического учреждения (код), где проводилось обследование;

— на предметном стекле готовят мазок крови более толстый, чем требуемый для исследования на малярию;

— сразу после приготоатения мазка, пока он не высох, наносят кровь из капилляра или апажной поверхностью мазка прикасаются к выступившей капле крови;

— приготовленный препарат кладут на горизонтальную поверхность, капля крови распределяется по влажному мазку, величина капель зависит от количества крови и ее реологических свойств (вязкость).

Рис. I. Толстые капли на предметном стекле без мазка

Рис. 2. Толстые капли на мазке

Толщина толстой капли должна быть такой, чтобы через нее после высыхания просматривался газетный текст. Слишком толстая капля может оторваться от стекла при высушивании; такой препарат не пригоден для исследования. Маркировка препарата производится на мазке крови между каплями.

Толстая капля на мазке имеет преимущества, так как на мазке чаще сохраняются нс полностью гемолизированные эритроциты, что может помогать дифференциальному диагнозу, поскольку в мазке, несмотря на гемолиз, могут сохраняться азурофильные элементы в эритроцитах (зернистость Шюффнера, Джеймса и пятнистость Маурера). Капля крови, нанесенная на мазок, более прочно прикрепляется, чем нанесенная непосредственно на предметное стекло.

Независимо от методики приготовления показателем достаточного содержания крови в толстой капле является обнаружение в 1 поле зрения микроскопа в среднем 10—20 лейкоцитов (увеличение: объектив х90—хЮО. окуляр х7; х8; хЮ).

В особых условиях при дефиците стекол, особенно при массовых обследованиях, на предметном стекле одновременно готовят тонкий мазок и толстую каплю.

Рис. 3. Комбинированное приготовление препаратов крови

Этот метод, однако, требует ряда предосторожностей. Для того чтобы оба препарата были пригодны для исследования, необходимо начинать с окраски толстой капли погружением соответствующего участка предметного стекла в раствор краски. Затем фиксируют тонкий мазок и окрашивают его. Нельзя начинать с фиксации тонкого мазка, так как даже при очень аккуратном погружении в фиксирующую жидкость участка предметного стекла, на который нанесен тонкий

мазок, в толстой капле эритроциты могут подвергнуться фиксации парами фиксатора. При последующей окраске такая капля станет непригодной для исследования, даже если фиксация была неполной.

Высушивание толстых капель на солнце, огне или любом другом источнике тепла неконтролируемой температуры исключается, так как вследствие фиксации необходимый при окраске гемолиз не происходит и препарат становится непригодным для исследования.

Толстые капли (особенно в процессе высыхания) и фиксированные тонкие мазки следует беречь от тараканов, мух и муравьев.

4.4.2. Препарат тонкий липок

Препарат тонкий мазок делают так же, как для подсчета формулы крови.

1. На край предметного стекла, отступив 0.5—1.0 см. наносят небольшую каплю крови.

2. Предметное стекло с нанесенной каплей кладут на горизонтальную поверхность стола, при этом край стекла с каплей крови должен быть справа 1 .

3. Двумя пальцами левой 1 руки предметное стекло за боковые поверхности фиксируется на столе.

4. Край шлифованного стекла (фиксированного в правой 1 руке) ставится под углом 45 е к предметному стеклу, прикасаясь к левому 1 краю капли крови.

5. После того как капля растекается по линии касания в месте соприкосновения обоих стекол, шлифованное стекло быстрым движением продвигают справа налево 1 к противоположному краю предметного стекла, постепенно ослабляя давление на предметное стекло, что позволяет закончить тонкий мазок бахромчатой частью, где эритроциты располагаются в один слой свободно, не налегая друг на друга, где четко видны специфические особенности морфологии паразитов и изменения пораженных эритроцитов. Мазок крови должен быть тонким, равномерным, не доходить приблизительно на l/з стекла до конца и краев предметного стекла (рис. 4).

Если угол наклона шлифованного стекла увеличить, то мазок получится короткий и толстый, с расположением эритроцитов в несколько слоев (это может маскировать некоторых паразитов, а также приводить к их деформации), если уменьшить угол наклона, то трудно создать бахромчатую часть мазка.

Качество тонкого мазка зависит также от правильной подготовки предметного стекла и равномерности края шлифованного стекла.

На плохо вымытом, жирном стекле и при дефектах на краю шлифованного стекла тонкий мазок получается неравномерным и с просветами. Возможные дефекты тонких мазков показаны на рис. 5.

Рис. 5. Дефекты приготовления тонких мазков

4.4.3. Маркировка препаратов крови

1. Высохшие препараты крови маркируют простым карандашом (он не смывается во время фиксации и окрашивания) или маркером, устойчивым к спирту.

2. Маркировка включает фамилию и инициалы, номер истории болезни или порядковый номер по списку обследуемого, дату и время взятия крови.

3. Препарат толстая капля, приготовленный непосредственно на предметном стекле, маркируют на полоске крови.

4.4.4. Фиксация тонких мазков

1. Фиксацию мазков проводят путем погружения: этиловым спиртом 96 е — 10 мин либо смесью Никифорова — 20 мин, фиксатором-красителем по Май-Грюнвальду — 2—3 мин.

2. Мазки погружают и извлекают из фиксирующей жидкости пинцетом.

3. Препараты по окончании фиксации высушивают на воздухе.

4. Препарат толстая капля на подкладке маркируют по мазку, не задевая каплю.

5. Тонкий мазок маркируют в толстой части, не захватывая тонкую часть и края препарата (не следует делать надпись вдоль всего мазка).

Препарат толстая капля не фиксируют!

При длительном хранении неокрашенных толстых капель при массовых эпид-обслсдованиях в очагах (особенно в жарком климате) может произойти их фиксация. При необходимости хранения толстых капель для предотвращения фиксации препараты до окраски следует обработать забуференным раствором метиленового синего (1 г метиленового синего + 3 г Na2HP04 + I г КН2Р04 + 300 мл дистиллированной воды). Толстую каплю после высыхания погружают в этот раствор на 1 с, промывают водой и высушивают. В таком виде каплю можно хранить длительное время. Перед исследованием такую толстую каплю окрашивают по Романовскому-Гимзс меньшее время, чем обычно — в течение 6—10 мин.

4.5. Окраска препаратов крови

Одним из основных условий правильной паразитологической диагностики малярии является качественная окраска препаратов крови. Окраску препаратов крови на малярию рекомендуется проводить в вытяжном шкафу, так как в состав краски и фиксаторов входят летучие токсические вещества.

Для лаборанта-лсвши вместо левого положения — читать правое, вместо правого — левое.

источник

Диагностика малярии основана на данных клинических проявлений, эпидемиологического расследования и лабораторных методах исследования, включающих методики выявления паразитов, их количества, видовую принадлежность и обнаружение антител в организме исследуемого. Обследованию в первую очередь подлежат пациенты из группы риска — прибывшие из эндемичных по малярии регионов, лихорадка у которых появилась в первые два года после выезда из этих регионов.

Рис. 1. Забор крови для приготовления препарата «толстая капля».

Рис. 2. Окраска и вид препаратов «толстая капля» и тонкий мазок.

Микроскопия препарата «толстая капля» и тонкого мазка, позволяющая обнаружить паразитов, их количество и видовую принадлежность, является ведущим методом диагностики малярии. Она проводится при малейшем подозрении на это заболевание, независимо от температурной реакции пациента. Для определения видовой принадлежности паразитов и стадии заболевания используется тонкий мазок крови. В толстой капле локализуется больше паразитов, чем в мазке. Этот метод диагностики превосходит методику определения наличия возбудителей малярии в тонком мазке крови в 20 — 40 раз.

В периферической крови паразиты обнаруживаются через определенное время после заражения:

  • при 3-х дневной малярии — через 8 — 12 дней,
  • при тропической — от пяти с половиной дней до 12,
  • при 4-х дневной — через 15 — 21 день,
  • при малярии, подобной 3-х дневной — через 9 — 15 дней.

Паразиты в крови присутствуют как во время лихорадочного приступа, так и в межприступный период и при паразитоносительстве.

Рис. 3. Техника приготовления тонкого мазка.

Полученная при проколе пальца капля крови наносится на предварительно очищенное и сухое предметное стекло и размазывается до получения пятна 1 см в диаметре. После подсушивания на воздухе предметное стекло заливается краской Романовского—Гимзы. По истечении 40-минутной экспозиции препарат ополаскивается под проточной водой и подсушивается при комнатной температуре, установленный в вертикальное положение.

Под микроскопом исследуется не менее 100 полей зрения. Более эффективным считается исследование 2-х толстых капель в течение 2,5 минут, чем 1-й капли в течение 5-и минут. 100 полей зрения просматриваются даже в том случае, когда малярийные плазмодии выявились уже в первых полях. Это производится для того, чтобы не пропустить микст-инфекцию.

Рис. 4. Микроскопия препарата «толстая капля» и тонкого мазка является ведущим методом диагностики малярии.

Порогом обнаружения малярийных плазмодиев называется минимальная концентрация возбудителей, которую возможно выявить при микроскопировании препарата «толстая капля». При заболевании этот показатель составляет 5 паразитов в одном микролитре крови. При просмотре 100 полей зрения обследуется 0,2 мкл крови.

При наличии косвенных признаков малярии (пребывание в эндемичных зонах, гипохромная анемия, обнаружение пигмента в моноцитах) и отрицательных результатов исследования препаратов «толстая капля», исследование вновь повторяется более тщательно, и не одно, а серия, состоящая из 4 — 6 препаратов при одном уколе, либо полученных при заборе крови, который производится 4 — 6 раз в сутки в течение 2 — 3 дней.

Интенсивность паразитемии определяется знаком «+».

  • 1 (+) обозначает выявление от 1 до 100 паразитов в 10 п/зр, что соответствует 5 — 50 плазмодиям в одном мкл крови;
  • 2 (+) обозначает выявление от 10 до 100 паразитов в 10 п/зр, что соответствует 50 — 500 плазмодиям в одном мкл крови;
  • 3 (+) обозначает выявление от 1 до 10 паразитов в 1 п/зр, что соответствует 500 — 5000 плазмодиям в одном мкл крови;
  • 4 (+) обозначает выявление от 10 до 100 паразитов в 1 п/зр, что соответствует 5000 — 50000 плазмодиям в одном мкл крови;
  • 5 (+) обозначает выявление более 100 паразитов в 1 п/зр, что соответствует более 50000 плазмодиям в одном мкл крови.

Интенсивность паразитемии можно вычислить по количеству паразитов на 100 эритроцитов в 10 полях зрения, либо по соотношению числа паразитов и лейкоцитов в 1 мкл крови.

По интенсивности паразитемии определяется прогноз при тропической малярии. При других видах заболевания более 2% эритроцитов не поражается.

источник

Ни один человек не застрахован от появления болезней, особенно если от этих болезней не существует прививок и медицинской профилактики. Заражение кишечными паразитами – как раз из этого списка. Наиболее распространенным таким заболевание является энтеробиоз. Это опасная болезнь, которая может привести к серьезным осложнениям, если дать ей время развиться.

В этой статье подробно рассказывается о том, как получить бланк направления на соскоб на энтеробиоз, как его правильно заполнить и какие справки для этого необходимы.

Энтеробиоз – кишечное заболевание, которое провоцируется отдельным видом червей-гельминтов – острицами. Их яйца изначально находятся в почве и попадают в человека, если он поест плохо промытых овощей или фруктов, выпьет нефильтрованной воды.

Наиболее распространено это заболевание у детей, поскольку к возможным путям заражения добавляются грязные игрушки и, если ребенок грызет ногти, грязь под ними.

Для избавления от паразитов наши читатели успешно используют Intoxic. Видя, такую популярность этого средства мы решили предложить его и вашему вниманию.
Подробнее здесь…

Характерной чертой энтеробиоза являются так называемые циклы заражения. Дело в том, что изначально в кишечник попадает совсем немного остриц. Они крепятся на стенки кишечника, и какое-то время питаются за счет организма-носителя.

В определенный момент самцы оплодотворяют самок, и, когда яйца внутри них разовьются, они отделяются и попадают в нижнюю часть пищеварительной системы.

Ночью через задний проход они выползают наружу и откладывают в складках кожи яйца, выделяя при этом особое вещество. Оно раздражает кожу и вызывает зуд. Человек чешет эти места, яйца попадают на его руки, и вместе с пищей оказываются опять в кишечнике. Это – новый цикл заражения, и на этот раз остриц в кишечнике становится гораздо больше.

Основные симптомы заражения энтеробиозом:

— зуд вокруг заднего прохода;
— боль в животе;
— снижение или полная потеря аппетита;
— тошнота;
— признаки интоксикации.

При проявлении первых признаков заражения следует обратиться к врачу и взять у него бланк анализа на энтеробиоз.

Что это такое – бланк направления на энтеробиоз? Это бумага, которая дает вам право сдать анализы для выявления у вас наличия или отсутствия болезни.

Направление выдать вам может только врач, в случае необходимости, либо если у вас имеются симптомы заболевания кишечными паразитами.

Анализ на энтеробиоз может браться двумя способами:

  1. Анализ кала.
  2. Соскоб из заднего прохода.

Второй способ более эффективен, поскольку позволяет выявить заболевание на любой из стадий развития, тогда как анализ кала может и не показать наличие паразитов при начальных стадиях заражения. На каждую из процедур дается отдельный бланк анализов.

Этот бланк обычно направляет в бактериологическую лабораторию. Он представляет из себя небольшой листок бумаги. На нем написан номер страхового полиса больного, а также его имя, фамилия и отчество. Кроме того, указан возраст обратившегося, адрес, возможный диагноз, фамилия, имя и отчество врача и дата обращения.

С этой бумагой больной идет в лабораторию с материалами для анализов. Направление у него забирают вместе с ними. Итоги анализа пишутся в самом направлении, кроме того ставится печать – положительный он был или отрицательный.

Бланк имеет небольшие размеры, где указана причина обращения в лабораторию и минимальные данные больного. На нем обычно указывается номер поликлиники, фамилия, имя и отчество обратившегося, а также его возраст. Кроме того, обозначается участок и домашний адрес. Чуть ниже оставлено место для написания результатов анализа, а также даты обращения и подписи лечащего врача.

Скачать бланк соскоба на энтеробиоз и посмотреть, как правильно его заполнять можно по ссылке.

Правильное заполнение бланка анализа на энтеробиоз включает в себя:

— Данные о пациенте: его фамилию, имя, отчество, адрес проживания и номер участка;
— Предполагаемый диагноз;
— Номер медицинской карты пациента;
— Наименование медицинского учреждения, куда пациент обратился;
— Код медицинского учреждения;
— Дата обращения и дата взятия анализа;
— Подпись и печать лечащего врача.

Таким образом заполняются все бланки на энтеробиоз. В случае необходимости вы можете заполнить все данные сами, и попросить врача только поставить печать и свою подпись.

Стоит сказать, что анализы на энтеробиоз сдаются не только при подозрении на заражение, но и для подтверждения его отсутствия. После того, как анализ сдан, пациент получается справку соскоба на энтеробиоз и анализа кала, где указано, болеет он или нет.

Эта справка нужна для того, чтобы подтвердить отсутствие болезни в определенных инстанциях. Например, для детей это нужно, чтобы записаться в спортивную секцию бассейна, или в летний лагерь. Взрослые же могут использовать ее для трудоустройства и также записи в бассейны и другие спортивные секции.

Именно таким образом и происходит взятие анализов на энтеробиоз у любого жителя России. При этом если анализы положительные – то врач выписывает весь необходимый курс лекарств и рекомендует правильное лечение. Стоит отметить, что подделать справки о том, что вы или ваш ребенок здоров, очень сложно, и не стоит делать этого. Мало того, что это наказуемо, но вы подвергаете опасности и других людей, которые могут также заразиться острицами.

Читайте также:  Малярия во вьетнаме статистика

  • Основные виды диагностики ВИЧ-инфекции
  • Анализ крови на ВИЧ. Что надо знать
  • Ложноположительный анализ на ВИЧ и другие виды результатов исследования
  • Тест-системы, определяющие наличие антител к ВИЧ
  • Тест-системы для подсчета СД4-лимфоцитов
  • Тест на ВИЧ с применением ПЦР
  • Культивирование вируса
  • Общий анализ крови на ВИЧ

Анализ крови на ВИЧ или тест на ВИЧ включает в себя несколько методов лабораторной диагностики, позволяющих выяснить присутствие вируса иммунодефицита (ВИЧ), обнаружить антитела к его белкам (иммуноглобулины) или антигены (белки вируса) в крови больного, слюне или моче. Вирусу иммунодефицита человека присуща уникальная антигенная изменчивость, что связано с большой скоростью транскрипции (размножения), в связи с чем затрудняется как диагностика ВИЧ-инфекции, так и ее профилактика.

В основе диагностики ВИЧ-инфекции, как и любого другого инфекционного заболевания лежит:

  • эпидемиологический анамнез,
  • характерные жалобы больного,
  • клиническая картина заболевания,
  • данные лабораторных методов исследования.

Как только диагноз ВИЧ-инфекции установлен, с целью уточнения характера течения основного заболевания и вторичных заболеваний проводится дальнейшее обследование больного и назначается соответствующее лечение.

Тяжесть заболевания оценивается по уровню концентрации вирусов в крови, количеству CD4-лимфоцитов и определению антигена р24.

Вирусологическая диагностика основана на выявлении ВИЧ в тканях и биологических жидкостях больного.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) применяется с целью выявления вируса и оценки вирусной нагрузки, что позволяет судить об эффективности специфического лечения и прогнозировать течение инфекционного заболевания.

Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции предполагает выявление антигенов вируса и антител в сыворотке крови. Обнаружение антител к вирусу иммунодефицита человека с помощью ИФА (иммуноферментного анализа) является основным методом лабораторной диагностики. Все положительные результаты подтверждаются методом иммуноблоттинга. Экспресс тест на ВИЧ основан на выявлении антител в крови и биологических жидкостях исследуемого. Используются в случаях, когда необходимо быстро получить результат.

Уровень иммуносупрессии определяется методикой подсчета СD4 и СD8-лимфоцитов, с последующим определением соотношения CD4 : CD8.

Каждый из лабораторных методов диагностики ВИЧ-инфекции характеризуется определенной чувствительностью (% верно определенных среди заведомо (+) образцов) и специфичностью (% правильно определенных тестов среди заведомо отрицательных образцов). Результаты теста на ВИЧ интерпретируются как отрицательные, положительные или сомнительные.

Анализ крови на ВИЧ может сделать любой житель нашей страны по своему желанию анонимно и бесплатно. Но есть категории лиц, которые обследуется на ВИЧ в обязательном порядке. К ним относятся:

  • все доноры крови и ее компонентов, а также тканей и других биологических жидкостей;
  • лица, которым была проведена трансфузия или осуществлена трансплантация (проводится в течение первых 3-х месяцев после проведения процедуры);
  • беременные;
  • лица, пострадавшие в результате аварии;
  • лица, имеющие клинические показания — лихорадку, диарею, постоянный кашель и увеличение более 2-х групп лимфатических узлов, длящиеся более 1-го месяца, необъяснимую потерю веса, СПИД-ассоциированные и оппортунистические инфекционные заболевания, соматическая и онкопатология;
  • иностранные граждане;
  • лица из группы риска (наркоманы и страдающие венерическими заболеваниями).

Тест на ВИЧ необходимо проводить всем, кто был подвергнут риску заражения.

Анализ на ВИЧ можно сдать бесплатно в учреждениях здравоохранения, работающих на бюджетной основе при наличии паспорта и медицинской страховки. Врачи при этом обязаны хранить врачебную тайну. Бесплатно и анонимно можно сдать анализ в Центрах профилактики и борьбы со СПИДом и там же получить врачебную консультацию до и после обследования. На платной основе проводится тестирование на ВИЧ в коммерческих лечебных учреждениях. Тест на ВИЧ может пройти любой человек, временно проживающий на данной территории.

В лаборатории будет сделан анализ крови на ВИЧ иммуноферментным методом (ИФА).

В государственных учреждениях здравоохранения (поликлиниках и больницах) анонимно сдать анализ крови на ВИЧ нельзя. Сведения о результатах исследования будут известны узкому кругу медиков, которые обязаны хранить врачебную тайну.

Для избавления от паразитов наши читатели успешно используют Intoxic. Видя, такую популярность этого средства мы решили предложить его и вашему вниманию.
Подробнее здесь…

Кабинеты анонимного тестирования существуют на базах Центров СПИДа, где каждому исследованию присваивается номер.

Существует четыре группы населения, тестирование на ВИЧ которых является обязательным, но не насильственным:

  1. Доноры крови и другого биологического материала.
  2. При устройстве на работу в учреждения, где работник может иметь контакт с заведомо инфицированным материалом и больными.
  3. Иностранные граждане при получении виз для проживания (более 3-х месяцев) на территории РФ.
  4. При наличии клинических показаний лицам, находящихся в местах лишения свободы.

Принудительное тестирование населения на ВИЧ является бесперспективным и противоречит соблюдению прав человека. Принудительное тестирование населения в РФ является незаконным.

В государственных учреждениях обследование на ВИЧ бесплатное, в частных клиниках — платное:

  • Стоимость ИФА составляет от 400 до 800 руб. Ответ будет готов по истечении одних суток. Существует срочная диагностика, когда ответ можно получить в течение 2-х часов.
  • Стоимость анализа на ВИЧ методом иммуноблота составляет от 3 до 5 тыс. рублей. Результат будет готов через 4 — 7 дней.
  • Стоимость теста на ВИЧ методом ПЦР составляет 10 — 12 тыс. руб. Результат будет готов через 10 — 14 дней.

В государственных учреждениях срок получения результатов анализа на ВИЧ составляет:

  • При применении ИФА 3-го поколения результаты дают самый достоверный результат через 12 недель от момента предполагаемого инфицирования.
  • При применении ИФА 4-го поколения — 6 недель.
  • При применении ПЦР — 4 недели.
  • Сдавать анализ на ВИЧ необходимо не ранее, чем через 3 — 4 недели от предполагаемого заражения.
  • Тестирование проводится не ранее, чем через 8 часов после приема пищи.

Из жидкости можно употреблять только обычную воду.

  • Для анализа осуществляется забор 3 — 5 мл крови, взятой из локтевой вены, для чего используется обычный шприц или игла с помпой.
  • До транспортировки в лабораторию сыворотка крови может храниться в холодильнике до 7-и дней. Без холодильника не более 30 минут после забора.
  • Транспортировка пробирок с сывороткой крови осуществляется в специальных термоконтейнерах при температуре +4 — +8оС.

При заборе крови из вены вирусом иммунодефицита человека заразиться невозможно.

Результаты анализа на ВИЧ могут трактоваться как положительные, отрицательные и сомнительные.

Сомнительный результат теста на ВИЧ получается при присутствии в сыворотке крови антител, которые перекрестно реагируют с белками вируса иммунодефицита человека. Анализ в данном случае сдается повторно, а при его проведении будут применяться белее специфичные тест-системы. Если сомнительный результат сохраняется, то тестирование необходимо проводить каждые 1 — 3 месяца в течение полугода.

Положительный результат теста на ВИЧ (серопозитивный) говорит о наличии в крови исследуемого антител к вирусу. В данном случае иммуноферментный анализ (ИФА) повторяется и при получении повторного положительного результата подтверждается тестом иммуноблотинга с тем же образцом крови.

Отрицательный результат теста на ВИЧ (серонегативный) говорит об отсутствии ВИЧ-инфекции, либо инфицирование произошло совсем недавно и в крови обследуемого еще не выработались антитела (период «окна»). В таком случае обследование следует повторить через 3 и 6 месяцев.

Ложноположительный результат теста на ВИЧ регистрируется тогда, когда его причиной явился не вирус иммунодефицита человека, а беременность, аутоиммунное заболевание, аллергия, любое другое инфекционное заболевание, недавно сделанная прививка, онкопатология, трансплантация органа и даже обычная еда (семечки, острая, жирная и кислая пища, употребленная накануне, и даже минеральная сильногазированная вода). Большое количество ложноположительных результатов получается при проведении тестирование в домашних условиях.

Ложноотрицательный результат теста на ВИЧ говорит о том, что вирус в крови больного присутствует, но антитела еще не выработались. При проведении анализа ПЦР ложноотрицательный результат может быть получен у ВИЧ-инфицированных больных в период проведения специфического лечения, когда концентрация вирусов в крови настолько мала, что приводит к несрабатыванию тест-системы. В большинстве случаев ложноотрицательный результат получается при технической ошибке или браке в тест-системе, что встречается крайне редко ввиду проведения жесткого контроля качества на всех уровнях.

Анализ на ВИЧ необходимо отложить минимум на две недели после перенесенного инфекционного заболевания или вакцинации.

При помощи тестирования на антитела к вирусу иммунодефицита человека оценивается ответ организма на инфицирование. С этой целью применяется иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA), позволяющий обнаружить антитела к белкам вируса и подтверждающий анализ иммуноблотинг (вестерн-блот), при помощи которого определяется реакция антител на белки вируса.

Вирусы иммунодефицита человека обладают антигенными свойствами и при попадании в организм человека вызывают синтез антител — специфических иммуноглобулинов. С помощью современных тест-систем в сыворотке крови и других биологических жидкостях больного ВИЧ можно определить класс иммуноглобулинов (антител). Раньше всех (через неделю после инфицирования) появляются иммуноглобулины класса IgМ. Их рост отмечается в течение месяца и далее они сохраняются еще около 30 дней. Иммуноглобулины класса IgG циркулируют в крови несколько лет. Их выявление является показателем наличия ВИЧ-инфекции.

Антитела к ВИЧ появляются через 2 — 4 нед. после инфицирования и далее они определяются в крови на протяжении всего заболевания.

Антитела в организме инфицированного человека вырабатываются не сразу. На первых порах ВИЧ-инфекция ничем себя не проявляет. Антитела появляются в крови в среднем через 2 — 3 месяца от момента заражения (от 2-х недель до 6-и месяцев). Этот период получил названия «окна», когда анализы на антитела еще отрицательные, но вирусы интенсивно размножаются, а сам больной становится опасным в плане заражения контактных лиц. Выявить инфицированного можно через более короткий (1 — 2 недели) период после заражения, для чего применяется полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако из-за дороговизны данный вид исследования для скрининга не используется.

У 90 — 95% инфицированных лиц антитела в сыворотке крови появляются через 3-и месяца после заражения, У небольшой части больных (5 — 9 %) антитела появляются в период от 3 до 9 месяцев и у 0,5 — 1% — в более поздние сроки. В терминальной стадии СПИДа количество антител снижается значительно, а в некоторых случая исчезают вовсе.

С 1985 года данная методика используется на территории РФ с целью массовых исследований. Он прост в исполнении, показывает довольно точные результаты, является дешевым по сравнению с другими методиками. В связи с возможностью получения ложноположительных результатов все положительные результаты исследуются дважды, после чего сыворотка крови больного исследуется подтверждающим тестом — иммунного блота. При этом используется тот же образец крови. При наличии 2-х положительных результатов с применением ИФА и иммуноблота в одной пробе ставиться диагноз ВИЧ-инфекции.

В РФ используются обычно ИФА 4-го поколения. Исследование проводится с целью получения суммарного спектра антител против белков (антигенов) ВИЧ — р24 и gр160.

Тест видит как антитела, которые вырабатываются организмом больного, так и антигены (белки вируса) р24. «Период окна» для тестов 4-го поколения более короткий. Уже через месяц можно получать достоверные результаты. Однако более надежными, как считают специалисты здравоохранения РФ, являются сроки 6, 8 или 12 недель.

Для первичного обследования групп лиц с целью выявления ВИЧ-инфекции применяется только методика ИФА.

Метод иммуноблотинга является более точным, чем ИФА, по мнению большинства специалистов — эталонным. С его помощью в сыворотке крови обнаруживают антитела к белкам ВИЧ. Методика применяется с целью подтверждения результатов, полученных при проведении ИФА. Обладает высокой специфичностью. Ложноположительные результаты встречаются редко. Достоверность полученных результатов достигает 99%. Иммуноблотинг является дорогостоящей методикой и требует высокой специализации специалиста, проводящего исследование. Возможно получение сомнительных результатов.

Метод основан на разделении антигенов (белков) ВИЧ с применением электрофореза по молекулярной массе. Первыми при инфицировании выявляются антитела против капсидных белков «Gag» (р24 и р17) и прекурсор р55. Вслед за ними появляются антитела против суперкапсидных белков «Env» (гликопротеидов gр 160, gр120, gр41 и белков р88) и неструктурных белков «Pol» (р31, р51 и р66). В ряде случаев могут определяться антитела против генов «vpu», «vpr», «vif», «tat», «nef», «rev», «tat».

Сыворотка крови больных ВИЧ-1 и ВИЧ-2 содержит антитела ко всем белкам вирусов, но для подтверждения диагноза определяются у ВИЧ-1 только антитела к белкам р24, gр41, gр120 и gр160, у ВИЧ-2 — антитела к белкам gр105, gр140 и gр36.

При наличии 2-х положительных результатов с применением ИФА и иммуноблота в одной пробе ставиться диагноз ВИЧ-инфекции.

Одним из иммунологических тестов, применяемых при ВИЧ-инфекции, является методика подсчета СD4 и СД8-лимфоцитов в крови.

СD4-лимфоциты (Т-хелперы) поражаются вирусами иммунодефицита. Постепенное истощение их популяции приводит к снижению иммунитета и организм больного перестает противостоять инфекции. Подсчет CD4-лимфоцитов осуществляется методом проточной цитометрии с помощью автоматических анализаторов или вручную при оптической или флюоресцентной микроскопии. По количеству СD4-лимфоцитов определяется время начала специфического лечения (антиретровирусной терапии) и профилактики оппортунистических инфекций, оценивается эффективность лечения.

  • При количестве CD4-лимфоцитов в сыворотке крови от 500 и ниже в 1 мл говорит о развитии иммунодефицита.
  • При снижении количества CD4-лимфоцитов до 200 в 1 мл (норма от 600 до 1900 клеток в 1 мл) развивается синдром приобретенного иммунодефицита — СПИД.
  • При снижении уровня CD4-лимфоцитов до 50 и ниже в 1 мкл СПИД переходит в терминальную стадию.

Удельный вес CD4-лимфоцитов среди всех лимфоцитов в норме составляет около 40%. Снижение показателя до 20% говорит о развитии СПИДа.

CD8-лимфоциты (Т-киллеры, на англ. killer — убийца) уничтожают вирусы ВИЧ путем цитолиза. Их пролиферация (увеличение количества) зависит от активности Т-хелперов. При ВИЧ-инфекции количество CD4 и CD8-лимфоцитов уменьшается, но более всего падает уровень CD4-лимфоцитов. Соотношение CD4/ CD8 в норме составляет 1,5 — 2,5. При снижении количества CD4- лимфоцитов отмечается снижение индекса.

Его величина менее 1 говорит о развившемся иммунодефиците, при показателе соотношения 0,6 — 0,8 развивается СПИД.

При получении положительных результатов тестирования человек должен стать на учет в государственное учреждение Центр профилактики и борьбы со СПИД, где будет установлен мониторинг за его состоянием и назначено адекватное специфическое лечение.

Все большее распространение в последние годы получает молекулярно-генетический метод диагностики ВИЧ-инфекции — полимеразная цепная реакция (ПЦР). С ее помощью определяется генетический материал возбудителя — РНК уже через 1 — 2 недели после предполагаемого заражения, а высокая чувствительность теста позволяет выявлять РНК вирусов даже если их в исследуемом материале находятся единицы. Данная методика является дорогостоящей и поэтому в настоящее время для скрининга не используется. К тому же значимой проблемой исследования является возможность получения ложноположительных результатов.

Суть данной методики заключается в получении множества копий РНК вируса (нуклеиновой кислоты), в последующем выявляемых как по характерному строению, так и с помощью меченых ферментов или изотопов.

С помощью ПЦР можно разрешить сомнительные результаты, полученные при применении методики иммуноблотинга, диагностировать ВИЧ-инфекцию на ранних стадиях (уже через 1 — 2 недели после предполагаемого заражения), контролировать эффективность проводимой антиретровирусной терапии, определять стадию заболевания.

Анализы ПЦР рекомендовано сдавать спустя 4 недели от момента предполагаемого риска.

  • С помощью ПЦР возможно выявить сам вирус и его количество.
  • Возможность использования у детей младше полутора лет.
  • Проводить оценку эффективности лечения.
  • Определить тяжесть и прогноз заболевания.
  • Большая стоимость исследования.
  • Наличие специализированных лабораторий.
  • Длительность получения результатов (до 4-х недель).
  1. Получение результата на 7 — 10 день лицам в случае предполагаемого инфицирования, когда желателен результат, полученный в короткие сроки.
  2. Для определения срока начала и оценки эффективности проводимого лечения.
  3. ПЦР проводится инфицированным беременным за 4 недели до родов с целью решения вопроса о применения кесарево сечения.
  4. Новорожденным от инфицированных матерей. Дважды полученный положительный результат свидетельствует о заражении ребенка.

В обычных условиях для скрининга и диагностики ВИЧ-инфекции ПЦР не используется

  • РНК ПЦР доказывает факт наличия вируса иммунодефицита в крови и объем выявленной РНК. Данное исследование применяется у диагностированных лиц с целью оценки эффективности проводимой терапии.
  • С помощью ДНК ПЦР определяется наличие вируса в мононуклеарных клетках у детей, когда антитела к вирусу иммунодефицита человека у матери мешает использовать методику ИФА.

Вирусная нагрузка определяется путем подсчета количества РНК-копий в 1 мл плазмы крови, что позволяет определить стадию заболевания, провести анализ проводимого специфического лечения, определить тяжесть и прогноз заболевания. Чем выше вирусная нагрузка, тем меньше в плазме крови регистрируется CD4-лимфоцитов.

  • РНК либо не выявлена, либо число копий РНК менее 20 в 1 мл. плазмы.
  • РНК выявлена на пределе чувствительности — менее 20 копий/мл.
  • РНК от 20 до 106 копий в 1 мл плазмы крови говорит о достоверности результата.
  • РНК-копий более 106мл — верхний предел линейного диапазона.

Увеличение вирусной нагрузки у больного с ВИЧ-инфекцией в три и более раза является клинически значимым результатом.

Контроль над вирусной нагрузкой проводится каждые 3 месяца у больных, лечение которым еще не проводится. В случае начала проведения антиретровирусной терапии контроль осуществляется через 2 — 8 недель.

Тест на ВИЧ необходимо проводить на ранних сроках инфицирования и периодически при заболевании, что обеспечит своевременное назначение антиретровирусной терапии предупреждение и развития грозных инфекционных и онкологических процессов.

Обнаружить вирусы, его РНК, ДНК, антигены и антитела можно не только в сыворотке крови, но и сперме, слюне, содержимом влагалища и др. Культивируют ВИЧ в культуре клеток лимфоцитов. Методика является высокочувствительной и специфичной (до 100%), однако дороговизна исследования не позволяет его использовать в повседневной лабораторной работе.

В результате поражения вирусами иммунодефицита человека кроветворных органов отмечается угнетение кроветворения, что проявляется снижением числа лимфоцитов (лимфопения), нейтрофилов (нейтропения), тромбоцитов (тромбопения) и анемия. К тому же на разрушение клеточных популяций оказывают влияние аутоиммунные процессы, развивающиеся у ВИЧ-инфицированных больных. В сыворотке крови больных доминирут иммуноглобулины IgG.

Сегодня сдать анализ на ВИЧ можно любому человеку анонимно и бесплатно за считанные минуты, а современное оборудование и обученный персонал позволяют получить максимально точные результаты.


Watch this video on YouTube

источник