Меню Рубрики

Риф в диагностике бруцеллеза

Возбудители бруцеллеза сельскохозяйственных животных — Brиcel1a mеlitеn­is, Вг. abortus и Вг. sиis — мелкие грамотрицательные бактерии шаровидной, овальной или более удлиненной формы, спор не образуют. По морфологическим признакам и основным биологическим свойствам бруцеллы разных видов разли­чить нельзя.

В первичных посевах из патологического и клинического материала бруцеллы растут медленно, но через 4-5 пересевов адаптируются к питательным средам и обычным условиям выращивания.

Материал для исследования: абортированный плод целиком или его части (желудок с содержимым, печень, селезенка), околоплодная жидкость, плодовые оболочки; молоко, содержимое гигром, абсцессов; от животных, убитых с диаг­ностической целью — паренхиматозные и половые органы, лимфоузлы.

Исследование проводят микроскопически, культурально и при необходимости биологически.

Микроскопия. Мазки из содержимого желудка, полостных экссудатов, печени и селезенки окрашивают по Граму и одному из специальных методов — по Коз­ловскому, Шуляку — Шину, Ганзену, Кюстеру или Степу.

Посевы делают от каждого плода из разных мест содержимого желудка нe менее чем в пять пробирок с бульоном и агаром; из полостных экссудатов, печени м селезенки — в одну пробирку с бульоном и 2-3 с агаром. Если доставлен только желудок, засевают не менее десяти пробирок . из разных участ­ков содержимого в отдельные пробирки с агаром.

Одну часть посевов инкубируют в обычных условиях, а другую (в расчете на рост Вг. abortus) — в эксикаторе, в атмосфере с 5-10% углекислого газа. Эти условия можно создать: а) подачей углекислого газа из баллона или аппа­рата Киппа; б) сжиганием этилового спирта — 2 мл спирта в часовом стекле ставят в эксикатор, зажигают и немедленно закрывают прибор; в). реакцией между 0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25%-ного раствора серной кислоты (то и другое в расчете на 1 л объема эксикатора); навеску соды в чашке Петри устанавливают в эксикаторе, вливают кислоту и быстро закрывают при бор.

Первичные посевы инкубируют при 37 ос в течение месяца (при отсутствии роста). Первый просмотр делают через 24 ч, а последующие — через 4-5 дней. С появлением роста из культур в бульоне и на агаре делают мазки, микроскопи­руют и делают пересевы на ага.р. Выделенные культуры проверяют микроскопи­чески с применением специальных методов окраски, в пластинчатой РА и в ре­акции иммунофлуоресценции (РИФ). Пластинчатую РА ставят с бруцеллезными монорецепторными сыворотками абортус (бовис) и мелитензис. Антигеном в реакции служит прогретая при 100 ос в течение 10 мин взвесь 1-2-суточной культуры, содержащая 60 единиц мутности по единому стандарту. На обезжи­ренные стекла наносят в 2-3 точки по капле антигена; на одном стекле к взве­сям добавляют по капле сыворотки мелитензис, на другом — сыворотки абортус (бовис); реагенты тщательно перемешивают и просматривают на темном фоне при боковом освещении; агглютинация, появившаяся с одной из сывороток. В первые две минуты, оценивается диагностически положительно; запоздалая реак­ция не учитывается. В описанных реакциях можно дифференцировать только Вг. melitensis биотипов 1 и 3 от Вг. abortus биотипов 1, 2, 3, 6 и 7.

Для РИФ готовят негустые мазки, фиксируют этиловым спиртом 15 мин и окрашивают бруцеллезной флуоресцирующей сывороткой, взятой в рабочем разведении, 30 мин при 37 0 С. Дальнейшую обработку препаратов и микроскопию ведут, как описано в иммунолюминесцентной микроскопии. Положительным результатом следует считать свечение типичных по форме микробов на + + и выше. В РИФ можно точно выявлять возбудителей бруцеллеза, но дифферен­цировать их по видам нельзя.

Биологическое исследование про водят на двух морских свинках, дающих отрицательную пробирочную РА с бруцеллезным антигеном при разведении сыворотки 1:5. Взвесь из органов и содержимого желудка плода вводят под­кожно в дозе 1-2 мл. Через 10, 20 и 30 дней у свинок берут кровь и ставят пробирочную РА с сывороткой, разведенной 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80. Биопробу считают положительной при наличии РА с сывороткой в разведении 1:10.

Реагирующих свинок убивают и делают посевы из паренхиматозных органов и измененных лимфоузлм. При отрицательной РА животных выдерживают до восьми недель, затем убивают и делают высевы из паховых, подчелюстных, шей­ных и гипогастральных лимфоузлов, селезенкИ’, печени и костного мозга. Наблю­дение за посевами ведут до 30 дней.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

  • Главная
  • «ПРОФИЛАКТИКА И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЛЮДЕЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 3.1.7.1189-03» (утв. Главным государственным санитарный врачом РФ 30.01.2003)
Наименование документ «ПРОФИЛАКТИКА И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЛЮДЕЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 3.1.7.1189-03» (утв. Главным государственным санитарный врачом РФ 30.01.2003)
Вид документа методические указания
Принявший орган главный государственный санитарный врач рф, минздрав рф
Номер документа МУ 3.1.7.1189-03
Дата принятия 01.01.1970
Дата редакции 01.01.1970
Дата регистрации в Минюсте 01.01.1970
Статус действует
Публикация
  • М., Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава РФ, 2003
Навигатор Примечания

5.4.2. Реакция иммунофлюуоресценции (РИФ), прямой метод

При исследовании патологического материала от больных людей и животных, а также из объектов внешней среды может быть эффективен прямой иммунофлюоресцентный метод, позволяющий выявлять как живые, так и нежизнеспособные бактерии по свечению в них специфического антигена. Для обнаружения бруцелл применяют флюоресцирующие бруцеллезные антитела.

А) Приготовление препаратов для люминесцентной микроскопии.

При исследовании воды готовят мазки (не менее 3 — 4) из осадка после центрифугирования и с мембранных фильтров. Мазки фиксируют в метиловом спирте 10 — 15 минут.

Мазки, приготовленные из проб цельного молока, сливок и осадка, после центрифугирования обезжиривают эфиром в течение 20 минут и дополнительно фиксируют 96° спиртом в течение 20 минут.

Мазки, приготовленные из мясного экстракта или осадка, фиксируют 96° спиртом в течение 20 минут.

Из селезенки белых мышей, которым был введен исследуемый материал, готовят препараты-отпечатки, которые фиксируют 96° спиртом в течение 15 — 20 минут при 37 °C или метиловым спиртом 15 минут при комнатной температуре.

При исследовании материала от абортированных плодов, различных экссудатов и органов инфицированных животных и людей готовят препараты-отпечатки, прикладывая предметное стекло к поверхности свежего среза. Затем препараты подсушивают на воздухе и фиксируют этиловым спиртом в течение 15 — 20 минут при 37 °C или метиловым спиртом при комнатной температуре 15 минут.

Б) Обработка препаратов флуоресцирующими антителами.

На фиксированные мазки наносят каплю бруцеллезной сыворотки. Для гашения неспецифического свечения фона применяют бычий альбумин, меченый родамином, который придает клеткам и другим органическим частицам тусклое оранжево-красное свечение. Перед обработкой препаратов бруцеллезную люминесцирующую сыворотку и альбумин разводят до удвоенного рабочего разведения, указанного на этикетке (например, если рабочее разведение равно 1:20, то разводят 1:10). После этого альбумин и сыворотку смешивают в равных объемах и наносят на исследуемый препарат, который помещают во влажную камеру (чашка Петри с влажной фильтровальной бумагой на дне) на 15 — 20 минут, затем промывают проточной водопроводной водой в течение 10 минут и высушивают на воздухе. На препарат наносят каплю забуференного глицерина (9 частей глицерина и 1 часть забуференного физиологического раствора), покрывают покровным стеклом и исследуют под люминисцентным микроскопом.

Для микроскопии используется люминисцентный микроскоп МЛ-2 при силе тока 4,5, объективы 90 и 100 и окуляры 5x или 7x (в зависимости от освещенности препарата). Светофильтры следует располагать следующим образом: (от источника света) СЭС-14-14, БС-8-2, ФЗ-1-2. Окулярный фильтр Т-2Н или Ж-18, вспомогательная линза — 1,6. При микроскопии препаратов следует пользоваться нефлюоресцирующим маслом.

В положительных случаях, т.е. когда в исследуемом материале имеются бруцеллы, в микроскопе на темном или оранжево-красном фоне видны клетки с ярким зеленым свечением по периферии. Центральная часть клетки не светится. Конгломераты бруцеллезного антигена имеют также яркое зеленое свечение.

Для оценки интенсивности специфического свечения используют четырехкрестовую систему.

Сверкающая флюоресценция зеленого цвета с четко выраженной формой клетки — четыре креста. Яркая флюоресценция зеленого цвета — три креста. Заметная, но слабо выраженная флюоресценция, — два и один крест.

Положительным результатом считается флюоресценция, оцениваемая на четыре и три креста при наличии 2 — 3 клеток в каждом поле зрения препарата.

источник

В пяти рабочих пробирках готовят разведения иссл сывки от 1:50 до 1:800 с парными разведениями. В 1-ю вносят 4,9 мл, в остальные по 2,5 мл изотонического раствора хлорида натрия.

В 1-ю вносят 0,1 мл иссл сывки. (1:50), перемешивают, титруют, перенося из предыдущей пробирки в послед 2,5 мл жидкости.

Из пятой пробирки после перемешивания удаляют 2,5мл жидкости и дизинфиирующий рр. Во все рабочие пробирки добавляют 0,5 мл бруцелезного диагностикума.

Готовят контроли диагностикума: 0,5 мл бруц. лиагн, 2,5 мл изотон рр NaCl и сывки, содерж 2,5 мл сывки разведенной 1\50 и 0,5 мл изотон. рр NaCl.

Встряхивают, инкубируют (37С, 2 часа), затем при комнатной темп — 18-20 ч.

Учет. “+” — образование рыхлого с фестончатыми краями осадка (зонтик).

“-” — компактны, с ровными краями осадок в виде “пуговки”.

Сравнивают титр антител в исследуемой сывке с диагност, который для реакции РАйта составл. 1:200. Если титр равен или превышает диагностический = “+”, подтверждается наличие заболевания.

Учесть результаты РСК в диагностике ку-лихорадки.

Ингридиенты: Сыворотка больного с антителом диагностикум, комплимент в рабочей дозе, гемолитическая система.

Постановка: В рабочую пробирку добавляют первые три ингредиента, инкубируют 30 минут, добавляют гемолитическую систему, инкубируют 30 минут.

Заключение: можно диагностировать Ку-Лихорадку.

Учесть реакцию Вассермана серодиагностики сифилиса.

Определите факторы патогенности стафилококков предложенных тестах.

Гемолизин определяют путем посева испытуемые культуры на чашечке Петри с кровяным агаром. Спасибо инкубируют 37 градусов в течение 24 часов тачка вокруг колоний образуются зоны полного (Бета) или неполного, зеленящего гемолиза (Альфа).

Обнаружение Лецитиназы. Посев иссл культ на пит агар с лецитином (желт агар). Вокруг колоний, выделяющих фермент, образуется зона помутнения с перламутровым блеском.

Плазмокоагулаза. Выявляется при посеве исп культ в 0,4 мл стерильной цитратной плазмы крови. Инкуб. 37С 2-5 ч. Если обр. фермент — свертывание плазмы, образование геля. В контроле остается жидкой (золь).

45. Определить Коли индекс воды в родильном методом и дать заключение.

Компоненты среда эйкмана тест проба воды из середины реки на глубине 1 м.

Состав среды эйкмана: вода

Плюс результат есть бактерии группы бгкп

Минус результат нет бактерии бгкп

Заключение: вода непригодна для питья.

46. Определить Коли индекс воды мембранных фильтров и дать заключение.

Постановка: пропускают 100 мл воды через фильтр. Посев в чашечку Петри на МПа. Инкубация. Обнаружение колонии красного цвета наличие бгкп. Следовательно вода непригодна для питья.

Заключение: вода не пригодна для питья.

47. Учесть реакцию манчини с целью количественного определения иммуноглобулинов в сыворотке крови больного.

Произвести учет цпд в культуре ткани с помощью микроскопа.

Мазок 1. нормальная культура клеток. Клетки с ярко выраженной цитоплазм. мембраной, цитоплазмой и ядром. Клетки равномерно распределены на мазке.

Мазок 2. цитопатическое действие вируса на клетки. Наблюдаем полную или частичную дегенерацию клеток за счет внутриклеточной репродукции вируса, что проявляется в уменьшении кол-ва клеток, а также изменении формы и формировании симпластов.

Произвести учет цпд в культуре тканей по цветной пробе.

Цветная реакция оценивается по изм. цвета индикатора находящегося в пит среде культивирования.

Если вирусы не размножаются, то живые клетки выделяют кислые продукты и изменяют PH и соотв цвет индикатора.

При продукции вирусов нормальнй метаболизм клеток нарушается, клетки гибнут и среда сохраняет свой обычный цвет.

1 пробирка. культура клеток, питательная среда н199, вирусологический материал.

2. пробирка. культура клеток, среда н199.

Учет: красный, желтый, красный.

Произвести учет РН с учетом по цветной пробе в диагностике полиомиелита.

Метод диагностики: вирусологический.

Компоненты: вирусологич материал, типоспецифические противовирусные сыворотки, культура клеток ткани.

Постановка: в культуру клеток ткани вносят вирусолог материал, типоспец. противовирусные сывки, инкубируют.

Заключение: вирусологич материал содерж вирус полиомиелита типа А.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ — конструкции, предназначен­ные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.

источник

I. Учтите и оцените результаты РИФ с синовиальной жидкостью обследуемого с подозрением на бруцеллез и люминесцирующей бруцеллезной сывороткой.

Тема: Микробиологическая диагностика бруцеллеза.

Цель: На основе знаний биологии бруцелл, особенностей их взаимодействия с макроорганизмом уметь обосновывать тактику микробиологической диагностики, специфическую профилактику и терапию бруцеллеза.

1. Правила работы с возбудителями особо опасных инфекций.

2. Классификацию, морфо-биологические особенности возбудителей бруцеллеза.

3. Особенности экологии, эпидемиологии, патогенеза и иммунитета при бруцеллезе.

4. Материал и методы микробиологической диагностики бруцеллеза.

5. Специфическую профилактику и терапию бруцеллеза.

1. Провести экспресс-диагностику бруцеллеза (РИФ).

2. Провести серо-аллергическую диагностику бруцеллеза.

1. Критерии принадлежности бруцеллеза к группе особо опасных инфекций. Правила ТБ при работе с бруцеллами, как возбудителями ООИ.

2. Классификация и морфо-биологические особенности возбудителей бруцеллеза.

3. Особенности экологии, эпидемиологии, патогенеза и иммунитета при бруцеллезе.

4. Материал и методы микробиологической диагностики бруцеллеза.

5. Специфическая профилактика и терапия бруцеллеза.

Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):

1. Учесть и оценить результаты РИФ с синовиальной жидкостью обследуемого с подозрением на бруцеллез и люминесцирующей бруцеллезной сывороткой. Сделать заключение.

2. Провести серо-аллергическую диагностику бруцеллеза:

2.1.Поставить, учесть и оценить результаты реакции Хеддлсона с сыворотками обследуемых.

2.2.Учесть и оценить результаты реакции Райта с сыворотками тех же обследуемых.

2.3.Учесть и оценить результаты кожно-аллергической пробы Бюрне (см. муляж).

3. Изучить и описать биопрепараты: живая бруцеллезная вакцина, лечебная бруцеллезная вакцина, бруцеллин, люминесцирующая бруцеллезная сыворотка, бруцеллезный диагностикум.

4. Контрольная работа: зоонозные инфекции (чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва).

Методические указания к выполнению исследовательского задания:

I. Учтите и оцените результаты РИФ с синовиальной жидкостью обследуемого с подозрением на бруцеллез и люминесцирующей бруцеллезной сывороткой.

Бруцеллез характеризуется многообразием клинических проявлений. Среди поражений доминируют нарушения опорно-двигательного аппарата, нервной и половой систем.

С целью экспресс-диагностики заболевания из исследуемого материала (синовиальной жидкости, пунктата костного мозга, СМЖ и др.) готовят препараты, которые изучают с помощью РИФ. Обнаружение в исследуемом материале светящихся мелких палочек или коккобактерий является основанием для предварительного диагноза «бруцеллез».

Бруцеллез относится к группе ООИ, поэтому исследование, предусматривающее работу с возбудителем, проводится только в специальных лабораториях.

II. Проведите серо-аллергическую диагностику бруцеллеза:

В обычной бактериологической лаборатории основой микробиологической диагностики бруцеллеза являются серологический и аллергический методы.

Серологический метод при бруцеллезе включает комплекс серологических реакций: РА, РНГА, РСК, РИФн, р. Кумбса, ОФР. Из вышеперечисленных реакций широко используется РА в 2-х модификациях: РА на стекле (р. Хеддлсона) и РА в развернутом ряду (р. Райта).

РА Хеддлсона используется при массовых обследованиях. Преимущества этой реакции заключаются в простоте ее постановки, быстроте получения результата, высокой чувствительности и специфичности. Чувствительность реакции обусловлена тем, что ее ставят с неразведенной сывороткой и концентрируемым диагностикумом. Это дает возможность выявлять специфические антитела, находящиеся в сыворотке в низких титрах. Для определения титра антител и динамики их накопления реакцию агглютинации проводят объемным методом в пробирках.

Аллергизация организма при заболевании бруцеллезом позволяет использовать аллергический метод (в/к проба Бюрне).

При этом разная степень информативности этих методов при острых и хронических формах, в разные периоды заболевания определяет большую диагностическую ценность комплексной серо-аллергической диагностики.

2.1. Поставьте, учтите и оцените результаты реакции Хеддлсона с сыворотками обследуемых.

Методика постановки: обезжиренное предметное стекло размером 9х12 см расчерчивают на 6 квадратов. В первом квадрате записывают номер сыворотки; в последующие квадраты вносят ингредиенты согласно таблице 1.

Схема постановки РА Хеддлсона

Примечание: физ. раствор, а затем сыворотка вносятся микропипеткой, диагностикум – пастеровской пипеткой.

Содержимое квадратов перемешивают, аккуратно покачивая стекло. Затем стекло равномерно подогревают над пламенем спиртовки до 37° около 2 мин. Стекло необходимо держать высоко над пламенем, чтобы капли не высыхали.

Критерии учета: в случае положительной реакции в первые же минуты появляются хлопья голубого или фиолетового цвета, т. к. бруцеллезный диагностикум окрашен метиленовой синькой или генцианвиолетом. Степень выраженности реакции должна быть не менее ++. Максимальный срок наблюдения 8 мин.

Критерии достоверности: в КС и КА должна отсутствовать спонтанная агглютинация.

— отсутствие агглютинации со всеми дозами сыворотки – результат отрицательный;

— положительная агглютинация с дозой сыворотки 0,04 мл – результат сомнительный;

— положительная агглютинация с дозами сыворотки 0,02-0,01 мл – результат положительный;

— положительная агглютинация на 4 креста со всеми дозами сыворотки – результат резко положительный.

Для диагностики бруцеллеза имеет значение только положительный и резко положительный результаты. В этом случае РА ставится в развернутом ряду (р. Райта).

2.2. Учтите и оцените результаты реакции Райта с сыворотками тех же обследуемых.

Реакция Райта ставится с разведениями сыворотки обследуемого и бруцеллезным диагностикумом, разведенным 1:10. Пробирки термостатируют при 37°С в течение 24 ч. Учет осуществляют по обычной схеме (см. занятие № 10). Диагностический титр реакции равен 1:200. При отрицательном или сомнительном результатах рекомендуется через 7-10 дней повторить реакцию.

Реакция Райта может быть положительной не только у больных, но у вакцинированных и переболевших, поэтому для определения инфекционной природы антител проводится исследование парных сывороток. Нарастание титра антител в 2 и более раз является достоверным серологическим подтверждением заболевания бруцеллезом.

2.3. Учтите и оцените результаты кожно-аллергической пробы Бюрне (см. муляж).

Обследуемому в / к вводят в область предплечья 0,1 мл бруцеллина. Учет реакции проводят через 24 и 48 ч, отмечая при этом размер папулы в см (длина и ширина), наличие гиперемии и болезненности по следующей схеме:

— папула отсутствует – отрицательная реакция;

— папула не больше 1х1 см – сомнительная реакция;

— папула размером 1х1-2,5х2,5 см – слабо положительная реакция;

— папула размером 3х3-4х4 см – положительная реакция;

— папула размером 6х6 см – резко положительная реакция.

При оценке результатов необходимо учитывать, что она может быть положительной не только у больных, но у переболевших и вакцинированных.

На основании полученных результатов реакций Хеддлсона, Райта и пробы Бюрне с учетом клинических и эпидемиологических данных сделайте вывод и заполните бланк-направление и бланк-ответ из лаборатории.

III. Ознакомьтесь и опишите в протоколе биопрепараты, указав, что они содержат, для чего и как применяются.

IV. При подготовке к контрольной работе по теме «Зоонозные инфекции (чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва)» рекомендуется придерживаться следующего плана:

1. Таксономия возбудителя: для бактерий — семейство, род, вид.

2. Характеристика бактериального возбудителя: морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические, антигенные свойства, факторы патогенности, резистентность к различным факторам.

3. Вызываемые заболевания: экология, краткая эпидемиологическая характеристика (источники инфекции, механизм, пути и факторы передачи, восприимчивый коллектив), патогенез, основные клинические проявления, особенности иммунитета.

4. Микробиологическая диагностика: исследуемый материал, применяемые методы диагностики; их обоснование.

5. Специфическая профилактика и терапия (вакцины, сыворотки).

1. Назовите основные виды бруцелл, вызывающие бруцеллез. Какой из них является наиболее вирулентным для человека.

2. Назовите и обоснуйте меры предосторожности при работе с возбудителями бруцеллеза или / и материалом от больных бруцеллезом.

3. Обоснуйте необходимость проведения противоэпидемических мероприятий в случае контакта с больными бруцеллезом.

4. Назовите методы микробиологической диагностики, которые можно использовать в обычной лаборатории. В чем их суть?

5. Назовите особенности выделения гемокультуры при бруцеллезе.

6. Тактика проведения неспецифической и специфической профилактики при бруцеллезе для лиц, проживающих в городской местности.

7. Тактика проведения неспецифической и специфической профилактики при бруцеллезе для лиц, проживающих в сельской местности.

1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2002. – С. 423-426, 427.

2. Медицинская микробиология / Гл. ред. В. И. Покровский, О. К. Поздеев. – М.: ГЭОТАР Медицина, 1998. – С. 323-329.

3. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. — М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С. 394-396.

Дата добавления: 2016-12-17 ; просмотров: 363 | Нарушение авторских прав

источник

Бруцеллез — зоонозная инфекция, характеризующаяся полиорганными патологиями и склонностью к хронизации. Значимым патогенетическим компонентом бруцеллеза является аллергическая реактивность. Передача бруцелл происходит в основном пищевым и водным путем, наиболее часто через молоко и мясо зараженных животных. У скотоводов может реализоваться воздушный и контактный путь передачи бруцеллеза. Диагноз устанавливается при выявлении возбудителя в крови, пунктате лимфатического узла или цереброспинальной жидкости. Серологическая диагностика может считаться достоверной при положительном результате сразу нескольких различных способов: ИФА, РЛА, РНГА, РИФ, РСК и др.

Бруцеллез — зоонозная инфекция, характеризующаяся полиорганными патологиями и склонностью к хронизации. Значимым патогенетическим компонентом бруцеллеза является аллергическая реактивность. Бруцеллез классифицируют по характеру течения, различая острую (продолжительность до полутора месяцев), подострую (не более четырех месяцев), хроническую (более четырех месяцев) и резидуальную (отдаленные последствия) формы.

Бруцеллез вызывается неподвижными полиморфными грамотрицательными микроорганизмами рода Brucella. Вид бруцелл, вызывающих инфекцию, оказывает влияние на тяжесть течения, наиболее тяжело протекает бруцеллез, обусловленный заражением Brucella melitensis. Бруцеллы высокоинвазивны, размножаются внутри клеток организма хозяина, но способны сохранять активность и вне клетки. В окружающей среде устойчивы, сохраняются в воде более двух месяцев, три месяца – в сыром мясе (30 дней — в засоленном), около двух месяцев — в брынзе и до четырех – в шерсти животных. Губительно для бруцелл кипячение, нагревание до 60 °С убивает их через 30 минут.

Резервуаром бруцеллеза являются животные, источником заражения для человека преимущественно являются козы, овцы, коровы и свиньи. В некоторых случаях возможна передача от лошадей, верблюдов, некоторых других животных. Выделение возбудителя больными животными происходит с испражнениями (кал, моча), молоком, амниотической жидкостью. Передача инфекции осуществляется преимущественно фекально-оральным механизмом, чаще всего пищевым и водным путем, в некоторых случаях возможна реализация контактно-бытового (при внедрении возбудителя через микротравмы кожи и слизистых оболочек) и аэрогенного (при вдыхании инфицированной пыли) пути.

Значительную эпидемиологическую опасность представляют собой молоко, полученное от больных животных и молочные продукты (брынза, кумыс, сыры), мясо, изделия из животного сырья (шерсть, кожа). Животные загрязняют испражнениями почву, воду, корм, что также может способствовать заражению человека непищевым путем. Контактно-бытовой и воздушно-пылевой пути реализуются при уходе за животными и обработке животного сырья.

При бруцеллезе у беременных существует вероятность внутриутробной передачи инфекции, кроме того, возможна постнатальная передача при лактации. Люди обладают высокой восприимчивостью к бруцеллезу, после перенесения инфекции в течение 6-9 месяцев сохраняется иммунитет. Повторное инфицирование бруцеллами отмечается в 2-7% случаев.

Инкубационный период бруцеллеза в среднем составляет 1-4 недели, но при формировании латентного носительства удлиняется до 2-3 месяцев. Острый бруцеллез обычно развивается быстро, у пожилых лиц начало может быть постепенным (в этом случае больные отмечают продромальные явления в виде общего недомогания, бессонницы, разбитости, артралгий и миалгий с постепенным нарастанием интоксикации на протяжении нескольких дней). Температура тела резко поднимается до высоких цифр, потрясающий озноб чередуется с проливным потом, развивается интоксикация, чаще всего умеренная, несмотря на выраженную температурную реакцию.

Лихорадочный период чаще всего составляет несколько дней, иногда затягиваясь до 3 недель или месяца. Больные отмечают расстройства сна, аппетита, головные боли, эмоциональную лабильность. На пике температурной кривой отмечается гиперемия и отечность лица и шеи на фоне общего побледнения. Выявляется умеренная полилимфоаденопатия – лимфатические узлы, преимущественно шейные и подмышечные, несколько увеличены в размерах и умеренно болезненные на ощупь. При острой форме также могут отмечаться более характерные для подострого течения бруцеллеза фиброзиты и целлюлиты – плотные болезненные образования по ходу сухожилий и мышц размером с горошину (иногда достигают размеров мелкого куриного яйца).

Для подострой формы бруцеллеза характерно чередование рецидивов лихорадки с периодами нормальной температуры. Лихорадочные периоды могу быть различной продолжительности, повышение температуры колебаться в пределах от субфебрилитета до крайне высоких значений (в том числе в течение суток). Лихорадка имеет направленный характер. Повышение температуры сопровождается интоксикационными признаками: болью в мышцах и суставах, парестезиями (ощущения покалывания, «мурашек» в различных частях тела) общей слабостью, снижением аппетита и нарушением сердечного ритма (на высоте лихорадки имеет место относительная брадикардия – несоответствие частоты ритма температуре тела). При нормальной температуре может отмечаться учащение пульса. Сердечные тоны приглушены. Больные испытывают жажду, жалуются на сухость во рту, нередки запоры.

Данная форма заболевания часто сопровождается фиброзами и целлюлитами. При тяжелом течении возможно развитие инфекционно-токсического шока, осложнения в виде воспаления оболочек сердца (перикардит). Подострая форма бруцеллеза сопровождается проявлениями аллергии – высыпаниями, дерматитом, сосудистыми реакциями и т.п.). Первым делом обычно страдает суставной аппарат: развиваются реактивные полиартриты, бурситы и тендовагиниты. Для мужчин характерно поражение яичек и их придатков, у женщин возможны нарушения менструаций, эндометриты. Бруцеллез при беременности может способствовать ее преждевременному прерыванию.

Протекает волнообразно, с проявлением симптоматики полиорганных поражений. При этом общеинтоксикационный синдром (лихорадка и интоксикация) обычно выражены умерено, температура редко превышает субфебрильные значения. Промежутки между обострениями заболевания могут продолжаться 1-2 месяца. В случае формирования нового инфекционного очага внутри организма происходит ухудшение общего состояния. Симптоматика хронического бруцеллеза зависит от преимущественного поражения той или иной функциональной системы возбудителем и выраженности аллергического компонента.

Часто развиваются воспаления суставов (артриты) и окружающих тканей, соединительнотканные патологии (фиброзы, целлюлит) в области поясницы и крестца, локтевых суставов. Иногда развивается спондилит, значительно ухудшающий состояние больных ввиду интенсивных болей и ограничения в движении. Суставы часто подвергаются деструкции и деформации.

Нередки у больных бруцеллезом невриты (в том числе воспаления зрительного и слухового нерва) и радикулиты, воспаления нервных сплетений, парестезии. Длительное течение заболевания способствует развитию реактивного невроза. При хроническом бруцеллезе также характерны аллергические воспаления половых желез и расстройства фертильности (бесплодие у женщин, импотенция у мужчин). Длительность заболевания может составлять 2-3 года и увеличиваться при повторном инфицировании.

Резидуальный бруцеллез – отсроченные последствия инфекции – связан с формированием патологической реактивности. Ввиду перестройки иммунологической структуры организма возможны специфические реакции организма – субфебрильная температура тела, психологические девиации, патологии суставов, соединительнотканных образований.

Кроме того, бруцеллез может оставлять после себя серьезные дегенеративные изменения фиброзной ткани, в особенности значимые в области нервных стволов и сплетений – высока вероятность развития контрактур, возникновения неврологической симптоматики (парезы, нейропатии). Длительное течение заболевания способствует формированию стойких функциональных нарушений со стороны опорно-двигательных структур ввиду необратимой деструкции суставных тканей и связочного аппарата (анкилоз и спондилез, контрактуры, мышечные атрофии). Нередко такие последствия бруцеллеза являются показанием к хирургической коррекции.

Бактериологическая диагностика производится в условиях специализированных лабораторий, оборудованных для работы с возбудителями особо опасных инфекций. Бруцеллы выделяют из крови, ликвора, пунктатов лимфоузлов, производя бакпосев биологического материала на питательных средах. Ввиду значительных трудозатрат выделение возбудителя редко производят в диагностических целях, достаточным для подтверждения диагноза является определение антигенов к бруцеллам в крови пациента и серологических тестов.

Антигены выявляются с помощью ИФА, РКА, РЛА и РАГА. Исследованию подвергается обычно сыворотка крови, но возможно обнаружение антигенов и в спинномозговой жидкости. Определение антител осуществляют при помощи РА, РНГА, РСК, РИФ, а также реакции Райта и теста на взаимодействие бруцелл с сывороткой больного. Достаточным для диагностирования считается положительный результат не менее чем в 3-4 различных серологических тестах. Начиная с 20-25 дня болезни и в течение длительного периода (несколько лет) после выздоровления отмечается положительная реакция на кожную пробу Бюрне (подкожное введение бруцеллина).

Амбулаторное лечение показано при легком течении инфекции. В случае тяжелого течения и угрозы осложнений производят госпитализацию. На период лихорадки больным показан постельный режим. Этиотропная терапия подразумевает назначение антибиотиков различных групп, один из препаратов обязательно должен обладать способностью проникновения сквозь клеточную стенку. Эффективно применение следующих антибиотиковых пар: рифампицин с доксициклином или офлоксацином, доксициклин со стрептомицином. В случае развития рецидива назначают повторный курс антибиотикотерапии.

В дополнение к базовой терапии назначают патогенетические и симптоматические средства: дезинтоксикационную терапию (в зависимости от тяжести интоксикации), иммуностимулирующие средства (экстракт тимуса крупного рогатого скота, пентоксил), новокаиновые блокады при спондилите и интенсивном радикулите, противовоспалительные средства (нестероидные препараты и кортикостероиды в зависимости от течения и суставных проявлений).

Ранее в комплексной терапии бруцеллеза применяли лечебную вакцину, но в настоящее время от этой практики отказываются ввиду выраженного подавления иммунитета и способности вакцины провоцировать аутоиммунные процессы. Во время ремиссий больным рекомендовано санаторно-курортное лечение, физиотерапевтическое воздействие (УВЧ, кварц, радоновые ванны и др.) и лечебная физкультура.

Обычно бруцеллез не становится причиной смерти больных, прогноз, как правило, благоприятен. В случаях длительного течения и развития стойких деструктивных дефектов суставного аппарата возможно ограничение трудоспособности.

В комплекс профилактических мер, направленных на снижение заболеваемости бруцеллезом людей включается ветеринарный контроль за состоянием здоровья сельскохозяйственных животных, а также санитарно-гигиеническое нормирование условий производства, хранение и транспортировки пищевых продуктов, ежегодные профилактические обследования работников сельского хозяйства.

Сельскохозяйственный скот подлежит плановой вакцинации, Также специфическая профилактика с помощью прививок живой бруцеллезной вакциной показана лицам, непосредственно работающим с животными. К средствам индивидуальной профилактики также относится спецодежда для работы с животным сырьем, строгое следование правилам личной гигиены.

источник

1.1. Бруцеллез — инфекционная, хронически протекающая болезнь животных.

Возбудитель — бактерии из рода бруцелла, в который входят шесть самостоятельных видов: мелитензис (овец и коз), абортус (крупного рогатого скота), суис (свиней), канис (собак), овис (баранов и овец) и неотома (кустарниковых крыс).

Микроорганизмы первых четырех видов вызывают бруцеллез животных, а пятого вида — инфекционный эпидидимит баранов (ИЭ).

От животных, больных бруцеллезом, могут заражаться люди, для которых наиболее опасен возбудитель бруцеллеза овец и коз.

1.2. Диагноз на бруцеллез у животных ставят на основании результатов бактериологического, серологического, молекулярно-генетического и аллергического исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни, руководствуясь при этом санитарными и ветеринарными правилами по профилактике и борьбе с заразными болезнями, общими для человека и животных.

1.2.1. При установлении диагноза на бруцеллез необходимо учитывать следующее:

— различные виды возбудителя являются патогенными, в основном, для животных соответствующего вида. Бруцеллы видов мелитензис, абортус и суис могут мигрировать на животных других видов;

— клинические признаки бруцеллеза у животных не характерны. Наиболее часто клиническое проявление болезни у маточного поголовья — аборт, у свиноматок наблюдается мумификация плодов.

При абортах отмечается утолщение плодовых оболочек, образование на них фибринозных или гнойных хлопьев. Бруцеллез сопровождается нередко поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой системы (у самок — эндометрит, вагинит, у самцов — орхит, эпидидимит);

— патологоанатомическая картина при бруцеллезе не имеет характерных особенностей, позволяющих использовать их для диагностики этой болезни. Только у свиней на слизистой оболочке матки иногда находят желтовато-гнойные или казеозные узелки величиной с просяное зерно, так называемый «милиарный бруцеллез матки»;

— у баранов, больных бруцеллезом, в семенниках и придатках обнаруживают некротические или гнойные очаги различной величины; отмечают заполнение полости мошонки серозно-гнойным транссудатом, разрастание фиброзной ткани, сращение придатка с семенником и общей влагалищной оболочкой, иногда атрофию семенников.

1.3. Диагностика бруцеллеза включает лабораторные (бактериологическое, серологическое и молекулярно-генетическое) исследования материала и аллергическое исследование свиней в хозяйствах.

Плановые серологические исследования являются основным методом выявления больных и подозрительных по заболеванию животных.

Бактериологическую диагностику проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание. Одновременно проводят серологическое исследование сывороток крови этих животных.

Читайте также:  Кожно аллергическая проба при бруцеллезе

Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) проводят в случае аборта и при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, из хозяйств, благополучных по данному заболеванию.

1.4. При взятии проб крови, молока и патологического материала, а также проведении лабораторных исследований необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.

2.1. Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности.

2.2. Для бактериологического исследования на бруцеллез направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от свиноматок берут не менее трех плодов) или селезенку, печень, желудок плода с содержимым, перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, и околоплодную жидкость.

Для прижизненной диагностики бруцеллеза от животных берут кровь, молоко, содержимое гигром (бурситов) и абсцессов. При диагностическом убое — дополнительно селезенку, печень, подчелюстные, заглоточные, предлопаточные, надколенные, подколенные, надвыменные, парааортальные, тазовые лимфатические узлы и половые органы. Жидкий материал берут в стерильную посуду (пробирки, банки).

При взятии содержимого гигром, бурс в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы (бурсы) и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в количестве 10 — 15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.

У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Молоко должно быть доставлено в лабораторию и исследовано в день взятия пробы. Если это невозможно, молоко консервируют сухой борной кислотой (0,1 г на 10 мл) или генцианвиолетом (0,4 мл 1%-ного спиртоводного раствора краски на 10 мл молока). Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 10 дней.

2.2.1. Отобранные для бактериологического исследования пробы упаковывают в целлофан или пергаментную бумагу, помещают в непроницаемую тару (ящик, банка, полиэтиленовый пакет) и в этот же день направляют в лабораторию. От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь (сыворотку крови) для серологического исследования на бруцеллез. Если в течение 24 — 30 ч взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в 4 — 5 раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.

2.3. Для серологического исследования в лабораторию направляют кровь (сыворотку крови) и молоко.

2.3.1. Кровь у животных берут из яремной вены (у свиней — из яремной, ушной или хвостовой; у собак — головной предплечья или латеральной подколенной голени; у лисиц и песцов — из бедренной вены; у норок — путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста в стерильные пробирки по 5 — 7 мл (от пушных зверей по 1 — 2 мл). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при 30 — 38 °С в течение 1 ч или при комнатной температуре 8 — 10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4 — 10 °С. Через 20 — 24 ч после взятия крови отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию в свежем или консервированном виде (сыворотку крови собак сливают через 3 — 4 ч и повторно через 10 — 12 ч).

Консервирование сывороток проводят:

— добавлением 0,05 мл (1 капля) 5%-ного раствора фенола на каждый миллилитр сыворотки при тщательном перемешивании;

— сухой борной кислотой (2 — 4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;

— путем однократного замораживания.

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут. со дня взятия крови при условии хранения их при 4 — 8 °С.

Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут.; замороженные сыворотки — в течение 3 сут. после однократного оттаивания.

Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.

2.3.2. Для исследования на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут сборную из каждой доли вымени одного удоя в одну стерильную пробирку в количестве 10 — 15 мл. При этом, если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и проч.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Молоко исследуют свежее (охлажденное до 4 — 10 °С или неохлажденное) или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10%-ного раствора формалина на 5 мл молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2 — 3 сут. Перед исследованием молоко необходимо тщательно перемешать для равномерного распределения сливок.

При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.

Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.

2.4. На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ установленной формы.

3.1. Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание.

3.2. Бруцеллы обнаруживают бактериоскопией мазков из патологического материала, выделением культуры бруцелл на питательных средах и, при необходимости, путем постановки биологической пробы на морских свинках.

3.3. Бактериоскопическое исследование

Из доставленного на исследование патологического материала делают по два мазка из каждого объекта. При исследовании абортированных плодов мазки готовят из содержимого желудка, жидкости брюшной и грудной полостей, печени, селезенки, а также котиледонов плодовых оболочек. Из паренхиматозных органов, котиледонов и другого плотного материала делают мазки-отпечатки, жидкий материал наносят на предметные стекла пипеткой.

Мазки, фиксированные над пламенем горелки, окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циль-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шину (см. Прил. N 1, п. 1). При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы — мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину в красный цвет.

3.4. Бактериологическое исследование

3.4.1. Для культивирования бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночный глюкозо-глицериновый бульон (ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), печеночный глюкозо-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар, эритрит-агар, сывороточно-декстрозный агар, печеночно-сывороточный агар и печеночно-аминопептидный агар, (см. Прил. N 1, п. 2) и другие питательные среды, предназначенные для этой цели.

3.4.2. Перед посевом материала кожу абортированного плода с поверхности по белой линии протирают тампонами, смоченными 5%-ным раствором фенола. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей набирают пастеровскими пипетками и высевают в 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром, а содержимое желудка — в 2 пробирки с бульоном и не менее 5 пробирок с агаром.

Из печени и селезенки вырезают кусочки размером не менее 2,0 х 1,5 х 2,5 см, увлажняют их спиртом, обжигают с поверхности и растирают в стерильной ступке с песком. Затем в ступку добавляют равное количество стерильного физиологического раствора и вновь растирают. Полученную взвесь пастеровской пипеткой по 0,1 — 0,2 мл высевают на поверхность предварительно подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается высев материала пастеровской пипеткой из органов (место прокола органа предварительно прижигают раскаленным шпателем). Из каждого органа делают посев на 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром.

Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем на 10 пробирок агара.

При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.

Из плодовых оболочек и плаценты вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений).

Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3%-ным раствором гидроокиси калия на 30 мин. Затем их обмывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала суспензию в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой на чашки со средой, содержащей бактериостатические препараты: генцианвиолет 1:200000 (0,1 мл 0,5%-ного спиртоводного раствора на 100 мл среды) или кристаллвиолет 1:100000, генцианвиолет и малахитовую зелень в концентрации каждой краски 1:200000, уксуснокислый натрий из расчета 12,5 мг на 100 мл среды и др.

Содержимое бурс, гигром высевают на 3 — 4 чашки с плотной питательной средой, содержащей бактериостатические препараты.

Пробы молока центрифугируют 30 мин. при 3000 об./мин. Верхний слой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0,1 — 0,2 мл вносят на 3 — 4 чашки с агаром, содержащим бактериостатические препараты. Молоко, консервированное генцианвиолетом или другими консервантами, высевают на среды без бактериостатических веществ.

3.4.3. Для выращивания культур посевы помещают в термостат при 37 — 38 °С.

При исследовании материала от крупного рогатого скота половину

засеянных пробирок и чашек культивируют в обычных условиях, другую

— в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (10 — 15%)

в СО -инкубаторе или эксикаторе (микроанаэростате). Аналогичные

условия можно создать в пробирках, закрытых резиновыми пробками

Перед парафинированием пробирки закрывают ватными пробками, пронося последние над пламенем горелки. Затем верхнюю часть пробки обрезают, а оставшуюся часть углубляют на 0,5 — 1,0 см внутрь пробирки и заливают расплавленным парафином.

Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:

— заполнения части объема углекислым газом из баллона или аппарата Киппа;

— внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25%-ного раствора кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л объема);

— сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора. Для определения концентрации углекислого газа в эксикаторе можно использовать химический метод (см. Прил. N 1, п. 3).

3.4.4. Посевы выдерживают в термостате при 37 — 38 °С в течение 30 сут. Первичный осмотр посевов проводят через 24 — 48 ч. Пробирки с агаром и бульоном, заросшие посторонней микрофлорой, обезвреживают путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.

В дальнейшем для обнаружения роста бруцелл посевы просматривают каждые 3 — 4 сут. визуально, при необходимости через лупу или малом увеличении микроскопа. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают посевным материалом.

При значительном росте посторонней микрофлоры (80% и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.

При просмотре посевов обращают внимание на характер роста микробов. На поверхности агара бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем свете — сероватый. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.

В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над уровнем бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.

При обнаружении роста на жидких средах и отсутствии характерного роста на агаре из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из специальных методов, и делают пересев на чашки с плотной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках культивируют так же, как и высевы из патологического материала.

Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним из специальных методов — по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на стекле с использованием набора компонентов для серологической дифференциации бруцелл.

Для постановки пластинчатой реакции агглютинации на стекле необходимы следующие компоненты: испытуемая культура, набор для серологической дифференциации бруцелл (выпускается биопредприятием), 0,5%-ный фенолизированный физиологический раствор рН 7,0 — 7,2.

Для исследования берут двухсуточные агаровые культуры. R- и S-сыворотки бруцеллезные агглютинирующие разводят 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором до рабочего разведения, указанного на этикетке коробки. Разведенные сыворотки допускается использовать в течение месяца. R-антиген бруцеллезный цветной для РА и антиген бруцеллезный для роз бенгал пробы в пластинчатой РА применяют неразведенными. Предметные стекла для реакции подготавливают общепринятым способом. Физиологический раствор, пробирки и пипетки должны быть стерильными.

Техника постановки реакции. На предметное стекло раздельно наносят по одной капле R- и S-сывороток бруцеллезных агглютинирующих и физиологического раствора. Испытуемую культуру бактериологической петлей отдельно эмульгируют в каплях R- и S-сывороток и в капле физиологического раствора для определения самоагглютинации культуры. Параллельно в каждом опыте ставят контроли: R- и S-сыворотки в разведении, указанном на этикетке, с цветным R-бруцеллезным антигеном и с роз бенгал антигеном.

Учет и оценка реакции. Реакцию учитывают невооруженным глазом или с помощью увеличительного стекла в течение 2 минут по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости с образованием четко выраженного агглютината — положительная реакция;

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости с выраженным агглютинатом — положительная реакция;

++ (2 креста) — неполное просветление жидкости со слабо выраженным агглютинатом — положительная реакция;

+ (1 крест) — жидкость без просветления с едва заметным агглютинатом — сомнительная реакция;

— (минус) — просветление жидкости не наступило, смесь гомогенная — отрицательная реакция.

Следует иметь ввиду, что реакция с R-бруцеллезной сывороткой проходит замедленно; агглютинат, как правило, мелкозернистый. Результаты реакции с испытуемой культурой считают достоверными, если в контролях R- и S- бруцеллезных сывороток с гомологичными антигенами агглютинация четко выражена не менее чем 3 креста, а с гетерологичными — отсутствует.

Реакцию с испытуемой культурой считают положительной при наличии агглютинации на 2 креста и более. При отрицательной реакции ее проводят повторно с этой же культурой, взятой из трех-четырех мест посева.

Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, культуральными и тинкториальными свойствами, а также дающие положительную реакцию агглютинации с R- и S- бруцеллезными сыворотками в отдельности или с обеими сыворотками одновременно при отсутствии самоагглютинации в физиологическом растворе, признают бруцеллами.

Культура возбудителя инфекционного эпидидимита баранов и бруцеллеза собак, вызванного B. canis, постоянно агглютинируется только R — бруцеллезной сывороткой.

3.5. Биологическое исследование

3.5.1. Биологическое исследование проводят на морских свинках (не менее двух) массой 350 — 400 г, предварительно проверенных на бруцеллез исследованием в РА сыворотки крови в разведении 1:5 с отрицательным результатом.

3.5.2. Для постановки биологической пробы используют тот же материал, что и для бактериологического исследования.

Из органов и содержимого желудка абортированного плода готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:10 и вводят морской свинке подкожно с внутренней стороны бедра в объеме 1 мл.

Из плаценты и плодовых оболочек, предварительно обработанных тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором, и подсушенных сухими стерильными тампонами, вырезают кусочки размером 0,5 х 0,5 см, фламбируют на пламени горелки, растирают в ступке со стерильным песком и заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят морской свинке в объеме 1 мл.

Читайте также:  Кровь на бруцеллез положительная

Содержимое гигром, бурс вводят морской свинке подкожно в объеме 0,2 — 0,3 мл. При этом необходимо учитывать возможность гибели животного от сопутствующей микрофлоры, особенно стрептококков.

Пробы молока центрифугируют 30 мин. при 3000 об./мин. Морской свинке вводят подкожно 2 — 3 мл материала из верхнего слоя (сливки) и осадка молока после центрифугирования.

3.5.3. На 15, 25 и 40-е сут. после заражения у морских свинок берут кровь в количестве 1 — 2 мл из ушной вены путем надреза или из сердца — путем пункции. Сыворотку крови исследуют в пробирочной РА в разведениях от 1:10 до 1:80.

При положительной реакции агглютинации в разведении 1:10 и выше морских свинок убивают. В случае необходимости получения культуры возбудителя материал от них исследуют бактериологически. Высевы делают пастеровскими пипетками в одну пробирку бульона и две пробирки агара из паховых, парааортальных лимфатических узлов (правых и левых), селезенки (2 высева), печени и костного мозга. Посевы культивируют, как описано в подпунктах 3.4.3 и 3.4.4.

При отрицательной РА у морских свинок в указанные выше сроки биопробу считают отрицательной, подопытных животных убивают, бакисследование не проводят.

3.5.4. При выделении культуры бруцелл на питательных средах из исходного материала биологическое исследование по данной экспертизе прекращают, а ранее зараженных морских свинок убивают без бакисследования.

3.6. Результат исследования на бруцеллез считают положительным при выделении культуры возбудителя или при получении у морской свинки положительной РА в разведении сыворотки крови 1:10 и выше, если из исходного материала культура не выделена.

При положительных результатах бактериоскопии и отрицательных результатах бактериологического исследования и биопробы материал считают подозрительным на бруцеллез. При сохранении патматериала или возможности взятия нового (кровь, молоко, моча и др.) исследование проводят методом полимеразной цепной реакции. По ее результатам делают заключение о заболевании животных бруцеллезом.

— бактериологического — до 1 мес.;

3.8. В ветеринарных лабораториях все выделенные культуры бруцелл после их идентификации подлежат уничтожению путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.

3.9. При необходимости определения вида бруцелл выделенные от животных культуры направляют в республиканские, краевые, областные ветеринарные лаборатории или ветеринарные научно-исследовательские учреждения, в которых имеются лаборатории или отделы, занимающиеся изучением бруцеллеза животных и имеющие разрешение органов здравоохранения на работу с микроорганизмами второй группы.

4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических антител в сыворотке крови животных в реакции агглютинации (РА) в пробирках, реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК), реакции иммунодиффузии с 0-полисахаридным антигеном (РИД), пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба — РБП) и в молоке коров — кольцевой реакции (КР) и других реакциях, утвержденных в установленном порядке.

4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации (РА) в пробирках

4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, лошадей, верблюдов, оленей (маралов), собак, пушных зверей и морских свинок.

4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:

— испытуемые сыворотки крови (см. п. 2.3.1);

— позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием;

— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных из опыта или консервированная), изготовленная биопредприятием или полученная в лаборатории;

— антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Прил. N 2, п. 6);

— 0,5%-ный фенолизированный раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и антигена используют фенолизированный физиологический раствор хлорида натрия (0,85%-ный); при исследовании крови овец и коз — 5%-ный и оленей (маралов) — фенолизированный 10%-ный раствор хлорида натрия (см. Прил. N 2, п. 1).

4.2.3. Постановка реакции агглютинации

Реакцию агглютинации проводят в серологических пробирках в объеме 1 мл в четырех разведениях:

— при исследовании сывороток крови овец, коз, оленей (маралов) и собак — 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200;

— крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

— пушных зверей и морских свинок — 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.

Компоненты реакции вносят индивидуальными мерными пипетками (дозаторами) или групповыми дозаторами Флоринского.

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках первого ряда делают исходное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирку, добавляют к ней 2,4 мл соответствующего раствора хлорида натрия, смешивают и получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови овец, коз, оленей (маралов) и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5). Таким образом делают исходное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда штатива (по 10 проб в ряду).

После приготовления исходного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского или индивидуальных пипеток-дозаторов переносят в пробирки второго и третьего рядов по 0,5 мл исходного разведения сывороток (1:25; 1:12,5 или 1:5). В пробирках третьего ряда сыворотки смешивают, по 0,5 мл этого разведения переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда — в пятый. Из пробирок пятого ряда 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные разведения сывороток.

После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разведенного 1:10 соответствующим раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сыворотки в каждой пробирке удваивается и, в зависимости от вида исследуемых животных, будет составлять 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, они служат контролем качества сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.

При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей) или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл при исследовании сывороток овец, коз, оленей (маралов) и собак. Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена, разведенного соответствующим раствором хлорида натрия 1:20. При этом разведения сывороток будут соответственно 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят контроли с негативной и позитивной бруцеллезной сыворотками в таких же разведениях.

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при 37 — 38 °С на 16 — 20 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.

4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки до и затем, после легкого встряхивания, оценивают в крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости, микробные клетки антигена осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик» (75% агглютинации);

++ (2 креста) — неполное просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен (50% агглютинации);

+ (1 крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик» выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25% агглютинации);

— (минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» не наступило, на дне пробирки по центру образуется небольшой осадок микробов антигена в виде точки или пятна. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимается вверх в виде косички и равномерно распределяется в жидкости, которая при этом приобретает первоначальную мутность.

За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц (МЕ) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с титром 1:100 содержит 100 МЕ, 1:200 — 200 МЕ и т.д.).

Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности, соответствующие 75, 50, 25 и 0% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания пробирок из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по 0,5 мл физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50 и 25% просветления жидкости. В четвертой пробирке просветление отсутствует. Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.

При массовых исследованиях в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.

4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сывороткой крови крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), верблюдов и лошадей, не иммунизированных или иммунизированных неагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами (см. Прил. N 2, п. 7), содержащей 200 МЕ антител и выше; овец и коз — 100 МЕ и выше; оленей (маралов) и собак — 50 МЕ и выше; пушных зверей и морских свинок — 10 МЕ и выше.

При выявлении среди не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, а также иммунизированных неагглютиногенными вакцинами крупного рогатого скота, верблюдов и лошадей, животных, реагирующих только в РА с содержанием антител 50 — 100 МЕ, а среди овец, коз, оленей (маралов), собак — 25 МЕ, считают сомнительно реагирующими и исследуют повторно через 15 — 30 сут. При повышении титров заболевание считают установленным. При сохранении титров на прежнем уровне проводят дополнительные исследования по дифференциации, согласно утвержденным методам.

При выявлении в стадах крупного рогатого скота, ранее иммунизированного против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами (см. Прил. N 2, п. 7), животных, реагирующих только в РА с содержанием не выше 200 МЕ антител и РСК в разведении сыворотки крови не выше 1:10, их повторно исследуют через 15 — 30 сут. в РА, РСК и РИД. При повышении содержания антител в исследуемых сыворотках в РА и (или) РСК или положительной РИД заболевание считают установленным.

При выявлении в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота, ранее не иммунизированных или иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, животных, положительно реагирующих в РА с содержанием 100 МЕ антител и выше, признают больными. Реакцию считают сомнительной при содержании 50 МЕ антител. Сыворотки крови от таких животных через 15 — 30 сут. исследуют повторно. При получении вновь сомнительного результата животных признают больными бруцеллезом.

При исследовании в РА неиммунизированных баранов-производителей, козлов, пробников и ярок, содержащихся в благополучных по бруцеллезу отарах, где овцы (козы) иммунизированы против бруцеллеза, реакцию считают положительной, а заболевание установленным при содержании в сыворотке крови животных 100 МЕ антител и выше. Реакцию считают сомнительной при наличии 50 МЕ антител. Сыворотки крови от таких животных через 15 — 30 сут. исследуют повторно. При получении вновь сомнительных результатов животных признают здоровыми, а отару — благополучной по бруцеллезу.

В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженный в международных единицах (например: титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:200 с оценкой 2 — 4 креста — «положительная» 200 МЕ; титр сыворотки 1:100 с оценкой 2 — 4 креста — «сомнительная» 100 МЕ).

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его годности, а также титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических исследований.

4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК)

4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов), собак и пушных зверей.

Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо РСК при исследовании на бруцеллез сывороток крови животных.

4.3.2. Компоненты реакции и их подготовка к работе:

— испытуемые сыворотки крови (см. п. 2.3.1);

— позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от больного бруцеллезом животного;

— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных из опыта или консервированная), изготовленная на биопредприятии или полученная в лаборатории.

Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной бане в день постановки реакции: для РСК — при 60 — 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов и мулов — 64 — 65, буйволов — 62 — 64, свиней — 58 — 60 °С); для РДСК — сыворотки крови животных всех видов — при 63 — 64 °С в течение 30 мин.;

— антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК в рабочем титре, указанном биопредприятием-изготовителем (см. Прил. N 2, п. 6);

— комплемент — сыворотка крови морской свинки, лиофильно высушенная, биофабричного изготовления или нативная (свежая или консервированная добавлением 2 — 4% борной кислоты).

Сухой биофабричный комплемент растворяют физиологическим раствором, как указано на этикетке коробки. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для проведения всего опыта количество комплемента. В каждую ампулу (флакон) вносят физиологический раствор и, не встряхивая, помещают в холодильник на 20 — 30 мин. Растворившийся комплемент осторожно перемешивают путем легкого встряхивания ампул (флаконов), сливают в одну пробирку, смешивают и помещают в холодильник при 4 — 10 °С. Непосредственно перед внесением в пробирки для титрования растворенный или нативный комплемент разводят физиологическим раствором 1:20, а остальной — хранят в холодильнике для постановки главного опыта. Рабочее разведение комплемента также готовят непосредственно перед внесением в пробирки главного опыта;

— гемолитическая сыворотка (гемолизин) — сыворотка крови кролика, гипериммунизированного эритроцитами барана, — для РСК и РДСК в удвоенном титре. Титрование гемолизина проводят при использовании каждой новой серии и по истечении срока годности (см. Прил. N 2, п. 5);

— эритроциты барана — 2,5%-ная от осадка взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе для РСК и РДСК (см. Прил. N 2, п. 3).

Для приготовления гемолитической системы взвесь эритроцитов и раствор гемолизина в рабочем разведении смешивают в равных объемах и при постановке РСК выдерживают в водяной бане при 37 — 38 °С в течение 15 — 20 мин. при периодическом перемешивании, а при постановке РДСК — в холодильнике. При смешивании компонентов раствор гемолизина вливают во взвесь эритроцитов;

— физиологический раствор — 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде с рН 6,8 — 7,2 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и кальция (см. Прил. N 2, п. 2). Последний в обязательном порядке готовят в случае использования нативного комплемента (свежей или консервированной сыворотки крови морской свинки).

Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции и при необходимости проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:

источник