Меню Рубрики

Набор для диагностики бруцеллеза овец

Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в РА, РСК, РДСК

Набор состоит из следующих компонентов:

— антиген бруцеллезный единый для РА, РСК, РДСК — взвесь инактивированных бруцелл вида abortus — 4 флакона по 20 см 3 или 8 флаконов по10 см 3 ;

— сыворотка бруцеллезная сухая — сыворотка крови быков (волов), гипериммунизированных культурой бруцелл вида abortus — 2 флакона по 2 см 3 ;

— сыворотка крови крупного рогатого негативная сухая — 2 флакона по2 см 3 .

По внешнему виду компоненты Набора представляют собой:

— антиген — непрозрачную жидкость серо-белого цвета, с выпадающим при хранении осадком микробных клеток, гомогенизирующимся при встряхивании;

— сыворотки бруцеллезная и негативная сухие — пористую массу бежевого цвета с желтоватым оттенком полностью растворяющуюся в дистиллированной воде в течение 5 минут с образованием прозрачной жидкости светло-желтого цвета без механической примеси, хлопьев, плесени.

Главным источником заражения является больное животное, которое передает возбудителя при случке. Отличительными признаками данного заболевания (у мужских особей) считается появление припухлости мошонки, наличие воспалительных процессов в семенниках и придатках (эпидидимит, орхит). При пальпации у животных обнаруживается увеличение одного или обоих семенников, хвоста или головки придатка семенника, при этом в пораженных участках повышается температура. Животное ощущает болезненность.

В некоторых случаях можно наблюдать увеличение семенников до больших размеров; встречается и ярко выраженная асимметрия. При хроническом течении заболевания случается разрастание фиброзной ткани, что приводит к сращению придатка с семенником и общей влагалищной оболочкой. Также происходит увеличение объема придатков (или одного придатка), которые к тому же становятся бугристыми и уплотненными.

Медсервис Калуга — это надежность и качество продукции для Вас! Быстрая и качественная работа с гарантией — вот наш девиз!Вы останетесь довольны сотрудничеством с нами.

Питательные среды и химические реактивы для лаборатории.

Стандарт-титр Серной кислоты 0,1 Н Стандарт-титр натрий гидроокись 0,1Н Стандарт-титр натрий серноватистокислый 0,1Н Метиловый красный Эриохром черный Т 0,05 кг Бромкрезоловый зеленый (синий) чда 0,05 кг Аммоний хлористый хч Натрий хлористый хч

Дезинфицирующее средство Надуксусная кислота марка НУК-15 С2Н3С(О)ООН

Перекись водорода применяют в легкой промышленности для отбеливания тканей и бумаги, в химической отрасли для производства глицерина и пероксидов. Востребован раствор перекиси водорода в медицине и пищевой промышленности.

Поставка реактивов и термометров для лаборатории.

Катрил-Био марка П кан 20кг Вода дистиллированная 5 литров

Химические реактивы и лабораторная посуда со склада в Калуге, поставка по разумным ценам.

Реагент HYDROCHEM 170 — кан 20кг Реагент HYDROCHEM 170 — кан 20кг

Микроскопы, кварцевые облучатели, дозиметры, нитратомеры в Калуге.

Фляга — бидон объёмом 10 литров алюминиевая поможет Вам сохранить и транспортировать пищевые продукты.

Среда № 2 ( Сабуро ) 1/250 гр Среда Кесслера 1/250 гр Среда Кода 0.250 кг Стафилококкагар д/выдел стафилакоков сух, 250гр. Набор красителей по Граму Термометр ТС-4М О..+100 Термометр ТТЖ 0. 200 / 103 Среда КМАФАнМ 250гр

Термостат ТС-1/80 СПУ (528х547х753) камера нержавейка Кушетка физиотерапевтическая Ширма 1 секциионная на колесах Термометр инфракрасный WF-1000

Сапонин диски Сыворотка крупного рогат.скота, 100 мл Среда Гисса с лактозой Среда Мюллер-Хинтон Стафилококкагар для выд стафилакоков сухая 1/250 гр Среда Кода — SDS-бульон 250гр Ерш бутылочный Ёрш пробирочный натуральная щетина, пластм. ручка Пробка силиконовая ПС-14,5 (пробирка 12-16 мм) Спиртовка СЛ-2 (V-100) Фитиль для спиртовок 10 шт Вата медицинская гигроскопическая хирургическая хлопковая 250 гр Халат медицинский женский (большой размер) Халат медицинский женский (большой р-р) Трубка силиконовая мед 8 /11 мм Пробка силиконовая ПС-28 (колба 25-32 мм) Тирозин L Бацитрацин S 0,04 ЕД 50 шт Оптохином диски индикат. Агар ПАЛ д/листерий 1/250 гр Энтерококкагар (среда для выд. энтерококков) 250гр Бинт марлевый, нестерильный размер 7м х 14см Марля медицинская отбеленная, ширина 90см, длинна 5 м

Моющее средство с активным кислородом Катрил-Био марка П.

источник

Наставление по диагностике инфекционной болезни овец, вызываемой Brucella ovis (инфекционный эпидидимит баранов)

Купить бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку «Купить» и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО «ЦНТИ Нормоконтроль»

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

2 Взятие материала от животных и пересылка его для лабораторных исследований

3 Бактериологическая диагностика

4 Методы серологической диагностики инфекционного эпидимита баранов

5 Аллергический метод диагностики инфекционного эпидидимита

6 Клинический и патологоанатомический методы диагностики инфекционного эпидидимита баранов

Приложение 1. Методы окраски бруцелл вида овис

Приготовление питательных сред

Определение концетрации углекислого газа

Приложение 2. Приготовление растворов и титрование

Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:

ill м ок> тля м-дтл in пика И СЛ’Л» ил I ГУ ДОПОЮ КРАСНОЮ MIAMI МИ АКАД1МИХ I Jtl»(KOXO *ЯИ1 ШИММУ НАУК НМ! НМ и И III НИНА • И I» И I* I киГ О I Д I и I It и I

н/чУчно-иссягдоклк 11||Г1.ин niinnivi Bf.TtPMt 1АГИИ ЦОСЮЧИОИ С.ИЬИт ОМСКИИ Г ОСУ Л АГС МКННЫИ

ВтГ’ИНА1Ч1ЫИ ИИ с профилактической целью также в молодом возрасте (4-6 месяцев). Эта мора особенно полезна в зонах, где 4-5 лет назад или в настоящее время наряду с ИЭ регистрируется и бруцеллез, так как будут про-филактировагься сразу две инфекция.

ИНОЕКЦИОННОГО ОПИДИДИМИТА БАРАНОВ Рекомендации

Вздактор Б. В. Стрибук Художественный редактор В.Е.Сафронов Технический редактор Н.И.Анищенко Корректор T.U. Немцева

Подписано к печати 0?.12.6£>. 101 02360». Формат 84×108 1/32 Уел.печ.л. 0,63 , уч.-изд.л. 0,7. Тираж 500 экз.Заказ J&566.

Редшщио1шо—лолд1рафическое объединение СО ВАСХНИЛ,ротапринт 633128, Новосибирская область

Инфекционный эпидвдимит (ИЗ) бараков — недавно открытая разновидность бруцеллеза овец, вызывазмого особым видом бруцелд — (Brucella ovio ). Наиболее чувствительны к возбудителю бараны, у которое поражается главным образом придаток оеме»шико — эпидидимис.

Хах)актористика возбудителя. Возбудитель ИЭ по морфало-пы»

и многим свойствам сходен с другими видами бруцелл.

Это очень мелкие бактерии, имеющие длину 0,5-1,5 мкм и ширину 0,34),? ш. Спор не образуют, жгутиков не имеют, неподвижны, грамотрицателыш. По методу Козловского окра-tv. хя в красный цвет (непостоянно). Кулыурц, ллптель-•» • _г»«_ »чеся на питательных, средах, проявляют широкую . шиботь морфологии, окраски, антигенных, огглюти-иаоельних я других свойств.

Сущос^вуот мнение, что это сильно изменявшийся варл-aj(T (к -форма) возбудителя обычного бруцеллеза овец,утративший п процессе эволюции характерный для типичных ( :н!м>м) бруцелл поверхностный лавопочисахуридн.чй (ЛИС) amv.roH и б значительной стопины вирулентное тъ.

Исто’яIаки возбудителя и пути распространена. Осн о t лшм истом;ikkom Hj .ovIb являются больные бараны.

Наиболее частый путь заноса возбудителя в ранее ньлучиые хозяйства (формы, отары) — ввоз шн]ю1ировон1!их льготных, чаще всего молодых племенных баранов, лрисб)>е

тынных в неблагополучном хозяйство.

Наибольшую опасность в распрострононми ИО представ* .jt инфицированная спорма, полученная от больных бароног на племирсдирннтиях (станциях искусственного осеменения).

Iuiomi. спермы возбудитель ИЭ монет отдаляться m организмы с >?пчой, калом и другими экскрементами и инфицировать помпу, корм и воду, о т/mo предметы уходе за г.нвот-и|ям, кормушкь, подстилку и друзме ооъоиты ишшней среда. Зедшоики 1Д01ЮПНХ овец происходит но только половым, по и a r>iMQjiriPHfw нуг^м. >■ также через слизистые оболочки гчаз, ПО.: Г Вий милости к кожным покров

Наибольшее раопросгранение инфекции среди баранов наблюдается в период естественного осеменения, когда бараны используются для так называемого докрытая.

Привэдсм два наиболее типичных примера.

В колхозе им. Ленина Кыринского района бараны (производители я пробники) перед случкой были исследованы .дважды — в шоно и сентябре 1976 г. Оба раза серологические реакции были отрицательными. При исследовании после осеменения в ноябре 1976 г. выделен один баран-производитель с положительной РДСК* в феврале 1977 г. — уже 5 баронов.

В колхозе им. Лазо Приаргунского района бараны перед случкой также имели отрицательные реакции, После осеменена в январе 1977 г. обнаружены по одной положительной и сомнительной реакции в РДСК, а в марта 1977 г. положительные реакции были уже у 35 животных.

Из этих примеров видно, что существенную роль в распространении возбудителя играют овцематки, которые являются связующим свеном в передаче Br.ovic от больных баранов здоровым. При этом они заражают не только барановг но и молодняк.

Патогенез, симптомы и течение инфекции. Опыты пс заражению баранов разными дозами и различными по вирулентности ку»р.тучами br.ovis показали что возбудитель* попав в оргилизм. первоначально локализуется в лимфатических узлах, расположенных возле ворот инфекции (первичная регионарная стадия инфекции), затем лимфой и кровью разносится в отдаленчче лимфатические узлы и паренхиматозные органы (генерализованная стадия). После х^енераоизации наступает вторичная регионарная стадия инфекционного процесса.В этот-период вогбудитель обнаруживается, как правило, только в половых органах — в придатках л теле семенников и продета-еотельных железах.

При активно протекающем инфекционном процессе у живот ных через 7-Х? дней после заражения появляются в крови специфические антитела и через 30-45 дней начинает развиваться аллергическое состояние. Сроки развития и последовательность проявления серологических и аллергических реакций могут сильно варьировать. У части инфицированных животных (10-20#) и более иамунореакции могут временно или постоянно отсутствовать.

Обследование 2000 баранов из хозяйотв, неблагополучных по ИЗ, показало у них клинические признаки, свойственные хроническому твчешш инфекционного процессе. При пальпации часто обнаруживаются уплотнения (узлы) в придатках я теле семенников. Хвост придатка иногда бывает увеличен в 1,5-3 раза; нередко встречается атрофия семекиысов,тогда они, как правило, сильно уменьшены и почтя неподвижны.Увеличение размеров мошонки, свойственное острому воспалительному процессу, встречается редко. В этом случае кока мошонки напряжена и болезненна, тестякулы почти не прощупываются из-за отечности тканей и скапливающегося экссудата; у некоторых баранов на мошонке образуются гнойные озищи.

Овцематки и молодняк более устойчивы к заболеванию,чем взрослые бараны. У большинства овцематок инфекционный процесс протекает скрыто (латентно) без выраженных сероаллергических реакций и клинических признаков. Однако у 9-382 овцематок после заражения может развиваться ярко вирапенный инфекционный процесс, сопровождающийся появлением в сыворотке кротзя специфических антител в высоких титрах и развитием аллергического состояния, а в некоторых случаях абортами и ровдением слабых, нежизнеспособных ягнят. В производственных условиях массовые аборты, как правиле,но наблюдаются, но в отдельных отарах ь скотный период сбор-тируют до 15-202 овцематок. Единичные случаи абортов бывают почти во всех неблагополучных по ИЭ отара.

Важной особенностью возбудктеля, попавшего в оргаяяз,? овцематки, является его сравнительно быстрая ь -трансформация, то есть переход к н — в Ь-форму и, как следствие, потеря обычной антигенной специфичности. Поэтому почти у всех зараженных овцематок (91-992; РДСК со стандартным оьисным антигеном бывает стрнцоюльной. Сроки прсби-вания таких измененных форм в организме инфицированных животных не ограничиваются сезоном осеменения, а гораздо продолжительнее — до года и более. Некоторые овцематки остаются носителями их, пг Bce’i вероятности, в течение всо:: лет производственного испатьзования.

Молодняк инфицируется чаще прк внутриутробном развитии в оргышзые больной матери и в первые месяцы жизни при сосении инфицированного молока. Однако заболевание у

них развивается в большинстве случаев только при достижении половой зрелости. До случной камлании обычно никаких нп иммунологических, ни клянжчоских признаков болезни у них нет. Именно с таким молодняком, у которого инфекция протекает окрито (латентно), занооится, как правило, возбудитель болезни в благополучные хозяйства и стада.

Диагностика. Диагноз заболевания, вызванного Br.ovis, устанавливают на основании результатов клинических, серологических, аллергических и бактериологических исследований с учетом епизоотологических и патолого-анатомических данных.

Клиническое обследование животных. Клиническому обследованию в начале подвергают взрослых баранов, которые использовались для естественного осеменения овцематок. Цри осмотре обращают вниманий на их общее состояний и состояние наружных половых органов: семенников, придатков. Животных, у которых обнаружены патологические изменения(увеличение, уменьшение, уплотнение семенников и придатков), характерные для инфекционного зпидилимита, изолируют и затем от них берут кровь для оерологячоокого исследования. Одновременно кровь берут и от всей группы (отары) баранов, в которой обнаружены животные, подозреваете в заболевании инфекционным эпидидимитом.

При установлении диагноза на ИЭ все поголовье хозяйства (фермы) исследуют комплексно, включая серологический и клин:гческий методы.

Серологический метод основан на выявлении в сыворотке крови исследуемых животных специфических к Br.ovia антител, и поэтому он особенно эффективен в начальных стадиях инфекционного процесса, когда идет активный синтез иммуноглобулинов.

Изучение диагностической эффективности реакции длительного связывания комплекта (РДСК) показало, что эта реакция очень специфична и позволяет своевременно установить наличие и степень распространения инфекции в отарах. Вместе с этим был выявлен и ряд ее иедоотатков. Установлено, что позитивная РДСК в отдельный сроки после заражения может «выпадать», то есть показания ее но строго постоянны. При повторных исследованиях, црозеденных через Г-34) месяцев, позитивные реакции могут исчезать у

пятой части естественно инфицированных баранов. Отрицательную ТОК имеют до 15-2056 баранов, являющихся носителями. Br.ovie и имеющих клинически траленные признаки эпидидямита.

Особенно неудовлетворительные результаты РДСК дает при исследовании овцематок из неблагополучных по ИЭ отар и молодняка. Это связано, с одной стороны, с особенностями инфекционного процесса у этих групп овец, с другой — с изменчивостью антигенных свойств возбудителя. Иногда эффективность ИЮК пропорциональна чувствительности применяемого R -антигена.

В отдельных случаях при исследовании снБоротки крови овец неблагополучных только по ИЭ отар могут быть получены положительные результаты в РА и РСК оо стандартным бруцеллезным 3 -антигеном. Это отмечается там, где в ОКОТНЫЙ период было много абортов. У абортировавших овцематок РА обычно бывает положительной при разведении сыворотки 1:50-1:100 и с оценкой реакция в 2 и 3 креста. Следует учитывать и возможность получить положительные РДСК с овисным антигеном при исследования овец в отарах, благополучных по ИЭ, но неблагополучных по бруцеллезу. Она определяется очень близким антигенным родством бруцелл ввдов о via и meiitenaia и образованием среди последних R3- и я -форм клеток (колоний).

Читайте также:  Акт на бруцеллез крс образец

Учитывая возможность таких перекрестных положительных реакций, первичный диатаоэ на ИЭ необходимо подтверждать выделением культур возбудителя на питательных средах и идентификацией их по общепринятой схеме.

Аллергический метод также применим для диагностики ИЭ, Установлено, что у баранов, зараженных бруцаллаыи о via , развивается аллергическое состояние, которое можно выявить пальпебральной и внутрикожной пробами. Аллергическое состояние наблюдается у значительной частя баранов, не имеющих серологических и клинических признаков болезни. Аллергия у многих развивается во 2-3-й мвояц после заражения и сохраняется у некоторых животных в течение 2 лет.

Степень аллергазшш организма овец находится в прямой зависимости от свойств возбудителя: долее вирулентные культуры Сруцелл вида о vie вызывают, соответственно, я более выраженную реакцию.

В зависимости от активности течения и степени распространения инфекции аллергической пробой дополнительно к РДСК и клиническому обследованию выявляется от 2 до 29% инфицированных баранов. Эта проба эффективна и при исследовании овцематок. Вели в РДСК выявляются только единицы реагирующих положительно овцематок, то аллергической пробой — 6-385С от количества исследованных животных. Особенно хорошие результаты дает эта пробе в длительно существующих очагах, где преобладает хроническая форма инфекции.

При изыскании аллергенов, пригодных для практического приме но идя, были испытаны бруцеллин ВИЭВ, бруцеллизат. а также аллергены, изготовленные из Br.ovia , Лучшие результаты получены при использовании ввдоспецифического аллергена — бруцеллоовина. При этом установлено, что пальпебральная проба более пригодна для аллергической диагностики ИЗ, чем ваутрикожная, в области подхвостовой складки. Эффективность первой пробы по сравнению со второй выше в 2-S раз.

Удовлетворительные результаты были получены и с бру-целлином ШЭВ, на который реагировало 63-77/С всех животных имеющих серологические реакции и клинические признаки СЫфЭКЦПИ Br.ovie.

Применение пальпебральной пробы бруцеллином в неблагополучных по ИЭ хозяйствах позволяет иногда выделять в 1,5-2 раза больше инфицированных свец, чем РДСК и клиническим методом. Введение этого препарата и учет реакция осуществляются так же, как при диагностике бруцеллеза, вызванного бруцеллемя ВЧДа molitensis.

Ириченекне аллергической пробы, в том числе и бруцелл*-.-ном ВИЗЬ. на^бедое цслесообрсзно орк широком распространения ИЭ и в отарах- со см&саиной инфекцией СИЗ и бруцачлеэ), когда одновременно можно выявить лквотаых, зараженных Вг. ovig a Br.iaeliter.sis , а также при контрольных профилактических исследованиях овзц благополучных хозяйств зоны, надсдяцейсй под угрозой заноса везбудктеля ИЭ v. бруцеллезе

Аллергическую пробу пока можно применять только как до-полягтв-льный Диагностический тест при определении степени. Хяг>прострьнш»ия инфекции в хозяйство (отаре), а также при выгоре жавот.чых для диагностического убоя и бактериологического исследозапил.

Бактериологическая диагностика включает 3 основных этапа: бяптериоскопию мазков из патологического материала, выдел энив чистой культуры возбудителя на питательных средах я, при необходимости, постановку биологической пробы на лабораторных животных. Этот метод применим и для исследований прижизненной и посмертной диагностики ИЗ.Для бактериологического исследования от животного нужно брать в первую очередь пробы органов (2,0×2,5 см) и димфатичеокяе узлы, имеющие видимые патологические изменения. Для взятия материала проводят либо специальный у о ой животных, либо кастрацию я взятие от баранов только сегоякинов и придатков, имеющих выраженные патололгческке изменения. При хронически протекающей инфекции возбудитель в 7O-I0C# случаев находится именно в этих органах. Дня прижизненной диагностики у барвнов удобным объектом исследования является и эякулят (сперма). При убое баранов дополнительно берут предстательные жэлезы, лимфатические узлы (срашше, паховые, тазовые, брыжеечные, предлопаточные, заглоточные, средостенные), кусочяя селезенки, печени, легких и почки.

От овцематок для исследования берут абортированные плоды, плодные оболочки (плаценту) и зеделенкч из плодных путей, а при убое — взмеыэшше участки матки, вымени, селезенки, печени, легких, почни и лимфатические узлы.

Если в точение суток взятой материал невозможно доставить в лабораторию,его консервируют стэрилъным ЗС5?-ы раствором химически чистого глицерина (1:5). Црц отсутствии этого консерванта материал замораживают в бытовом холодильнике или (в зимнее время) при минусовой естественной TOimeiWType. Такой материал .

При бактериоскопия патологического магерзада н вросших культур нужно учитывать сильно в^рааюкиую склонность в г. о via к патяморфизм/ и сбразовзндю гетзроморфн?;х культур в виде крупных « малких ко»:коб, овоидов, токкях нитей, гигантских шаров к элепсоядоз размером 3-5×10-12 м.чм,удда-авннх* зорвнетчх палочек и других необычных ферм. 1с.кие культуры к баацдякотБС случаев тзряюг способность к характерней оку-оекз по методу Козловского. :* прн с крас ко по

]>зому принимают фиолетовый и темно-синий цвета. Измененные клетки бруцелл даже в одном мазке часто бывают разнородны по форме, размерам и окраоке, что связано с различной степенью дефектности их клеточной оболочки. Встречаются также культуры в виде классических L-форм со всеми присущими им свойствами. Восстановить типичную морфологию и окраску измененных культур в некоторых случаях удается лишь путем многократных пересевов на полужидкие и плотные сывороточные среды или пассирования через организм морской свинки.

Бруцеллы вида о vis очень слабо или совсем не растут на питательных средах, применяемых для культивирования других видов. Поэтому для их выращивания рекомендуется применять плотные и полужидкие агаровые среды с добавлением 10-20% сыворотки крупного рогатого скота или амино-иептида. Хорошие результаты дает сухая среда — эритрит агаре. Выращивание культур возбудителя проводят в гкси-каторе при концентрации углекислоты 10-15%, для создания которой можно исиользовать бикарбонат натрия и раствори соляной а серной кислот. На X л воздуха требуется 0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25%-го раствора серной кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия я 0,35 мл концентрированной соляной кислоты. Удовлетворительные результаты дает сжигание в зкоякаторе ватного тампона, пропитанного спиртом. При отсутствии эксикатора ватные пробки можно заливать парафином или заменять резиновыми пробками. Посевы выдергивают б термостате при 37

Серологическую идентификацию выделенных от овец культур бручол* вида о vis проводят обычно путем 2-кратного внутривенного введения 2-3 кроликам 2 мл взвеси этих культур в концентрации 3-4 млрд м.т. в I мл с интервалом 7-8 дней и последующего исследования гтериммунной сыворот ки в РДСК со стендартным овиеным антигеном. Сыворотку кровь исследуют через 1J-1? дней после повторного введения культуры. Появление положительных РДСК при исследования кроличьих оывороток с овясннм антигеном свидетельствует о принадлежиосте изучаемой культуру к возбудителю ИЭ.

Могут выделяться измененные варианты ьозоудателя, вызывающие з организме кроликов антитела, которые яелякггся гетерогенными и не улавливаются в РДСК биофзбричгнм R -ан-

источник

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Департамента ветеринарии Е.А.Непоклонов 29 сентября 2003 г. N 13-5-02/0850

1.1. Бруцеллез — инфекционная, хронически протекающая болезнь животных.

Возбудитель — бактерии из рода бруцелла, в который входят шесть самостоятельных видов: мелитензис (овец и коз), абортус (крупного рогатого скота), суис (свиней), канис (собак), овис (баранов и овец) и неотома (кустарниковых крыс).

Микроорганизмы первых четырех видов вызывают бруцеллез животных, а пятого вида — инфекционный эпидидимит баранов (ИЭ).

От животных, больных бруцеллезом, могут заражаться люди, для которых наиболее опасен возбудитель бруцеллеза овец и коз.

1.2. Диагноз на бруцеллез у животных ставят на основании результатов бактериологического, серологического, молекулярно-генетического и аллергического исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни, руководствуясь при этом санитарными и ветеринарными правилами по профилактике и борьбе с заразными болезнями, общими для человека и животных.

1.2.1. При установлении диагноза на бруцеллез необходимо учитывать следующее:

— различные виды возбудителя являются патогенными, в основном, для животных соответствующего вида. Бруцеллы видов мелитензис, абортус и суис могут мигрировать на животных других видов;

— клинические признаки бруцеллеза у животных не характерны. Наиболее часто клиническое проявление болезни у маточного поголовья — аборт, у свиноматок наблюдается мумификация плодов.

При абортах отмечается утолщение плодовых оболочек, образование на них фибринозных или гнойных хлопьев. Бруцеллез сопровождается нередко поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой системы (у самок — эндометрит, вагинит, у самцов — орхит, эпидидимит);

— патологоанатомическая картина при бруцеллезе не имеет характерных особенностей, позволяющих использовать их для диагностики этой болезни. Только у свиней на слизистой оболочке матки иногда находят желтовато-гнойные или казеозные узелки величиной с просяное зерно, так называемый «милиарный бруцеллез матки»;

— у баранов, больных бруцеллезом, в семенниках и придатках обнаруживают некротические или гнойные очаги различной величины; отмечают заполнение полости мошонки серозно-гнойным транссудатом, разрастание фиброзной ткани, сращение придатка с семенником и общей влагалищной оболочкой, иногда атрофию семенников.

1.3. Диагностика бруцеллеза включает лабораторные (бактериологическое, серологическое и молекулярно-генетическое) исследования материала и аллергическое исследование свиней в хозяйствах.

Плановые серологические исследования являются основным методом выявления больных и подозрительных по заболеванию животных.

Бактериологическую диагностику проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание. Одновременно проводят серологическое исследование сывороток крови этих животных.

Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) проводят в случае аборта и при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, из хозяйств, благополучных по данному заболеванию.

1.4. При взятии проб крови, молока и патологического материала, а также проведении лабораторных исследований необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.

2.1. Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности.

2.2. Для бактериологического исследования на бруцеллез направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от свиноматок берут не менее трех плодов) или селезенку, печень, желудок плода с содержимым, перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, и околоплодную жидкость.

Для прижизненной диагностики бруцеллеза от животных берут кровь, молоко, содержимое гигром (бурситов) и абсцессов. При диагностическом убое — дополнительно селезенку, печень, подчелюстные, заглоточные, предлопаточные, надколенные, подколенные, надвыменные, парааортальные, тазовые лимфатические узлы и половые органы. Жидкий материал берут в стерильную посуду (пробирки, банки).

При взятии содержимого гигром, бурс в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы (бурсы) и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в количестве 10-15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.

У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Молоко должно быть доставлено в лабораторию и исследовано в день взятия пробы. Если это невозможно, молоко консервируют сухой борной кислотой (0,1 г на 10 мл) или генцианвиолетом (0,4 мл 1%-го спиртоводного раствора краски на 10 мл молока). Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 10 дней.

2.2.1. Отобранные для бактериологического исследования пробы упаковывают в целлофан или пергаментную бумагу, помещают в непроницаемую тару (ящик, банка, полиэтиленовый пакет) и в этот же день направляют в лабораторию. От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь (сыворотку крови) для серологического исследования на бруцеллез. Если в течение 24-30 ч взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в 4-5 раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.

2.3. Для серологического исследования в лабораторию направляют кровь (сыворотку крови) и молоко.

2.3.1. Кровь у животных берут из яремной вены (у свиней — из яремной, ушной или хвостовой; у собак — головной предплечья или латеральной подколенной голени; у лисиц и песцов — из бедренной вены; у норок путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста в стерильные пробирки по 5-7 мл (от пушных зверей по 1-2 мл). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при 30-38 °С в течение 1 ч или при комнатной температуре 8-10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4-10 °С. Через 20-24 ч после взятия крови отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию в свежем или консервированном виде (сыворотку крови собак сливают через 3-4 ч и повторно через 10-12 ч).

Консервирование сывороток проводят:

— добавлением 0,05 мл (1 капля) 5%-го раствора фенола на каждый миллилитр сыворотки при тщательном перемешивании;

— сухой борной кислотой (2-4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;

— путем однократного замораживания.

Читайте также:  Актриса умерла от бруцеллез

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при 4-8 °С.

Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут; замороженные сыворотки — в течение 3 сут после однократного оттаивания.

Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.

2.3.2. Для исследования на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут сборную из каждой доли вымени одного удоя в одну стерильную пробирку в количестве 10-15 мл. При этом, если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и проч.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Молоко исследуют свежее (охлажденное до 4-10 °С или неохлажденное) или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10%-го раствора формалина на 5 мл молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2-3 сут. Перед исследованием молоко необходимо тщательно перемешать для равномерного распределения сливок.

При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.

Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.

2.4. На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ установленной формы.

3.1 Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание.

3.2 Бруцеллы обнаруживают бактериоскопией мазков из патологического материала, выделением культуры бруцелл на питательных средах и, при необходимости, путем постановки биологической пробы на морских свинках.

3.3 Бактериоскопическое исследование

Из доставленного на исследование патологического материала делают по два мазка из каждого объекта. При исследовании абортированных плодов мазки готовят из содержимого желудка, жидкости брюшной и грудной полостей, печени, селезенки, а также котиледонов плодовых оболочек. Из паренхиматозных органов, котиледонов и другого плотного материала делают мазки-отпечатки, жидкий материал наносят на предметные стекла пипеткой.

Мазки, фиксированные над пламенем горелки, окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циль-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шину (см. Прил. N 1, п.1). При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы — мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину в красный цвет.

3.4. Бактериологическое исследование

3.4.1 Для культивирования бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночный глюкозо-глицериновый бульон (ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), печеночный глюкозо-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар, эритрит-агар, сывороточно-декстрозный агар, печеночно-сывороточный агар и печеночно-аминопептидный агар, (см. Прил. N 1, п.2) и другие питательные среды, предназначенные для этой цели.

3.4.2 Перед посевом материала кожу абортированного плода с поверхности по белой линии протирают тампонами, смоченными 5%-ным раствором фенола. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей набирают пастеровскими пипетками и высевают в 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром, а содержимое желудка — в 2 пробирки с бульоном и не менее 5 пробирок с агаром.

Из печени и селезенки вырезают кусочки размером не менее 2,0х1,5х2,5 см, увлажняют их спиртом, обжигают с поверхности и растирают в стерильной ступке с песком. Затем в ступку добавляют равное количество стерильного физиологического раствора и вновь растирают. Полученную взвесь пастеровской пипеткой по 0,1-0,2 мл высевают на поверхность предварительно подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается высев материала пастеровской пипеткой из органов (место прокола органа предварительно прижигают раскаленным шпателем). Из каждого органа делают посев на 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром.

Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем на 10 пробирок агара.

При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.

Из плодовых оболочек и плаценты вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений).

Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3%-ным раствором гидроокиси калия на 30 мин. Затем их обмывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала суспензию в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой на чашки со средой, содержащей бактериостатические препараты: генцианвиолет 1:200000 (0,1 мл 0,5%-го спиртоводного раствора на 100 мл среды) или кристаллвиолет 1:100000, генцианвиолет и малахитовую зелень в концентрации каждой краски 1:200000, уксуснокислый натрий из расчета 12,5 мг на 100 мл среды и др.

Содержимое бурс, гигром высевают на 3-4 чашки с плотной питательной средой, содержащей бактериостатические препараты.

Пробы молока центрифугируют 30 мин при 3000 об./мин. Верхний слой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0,1-0,2 мл вносят на 3-4 чашки с агаром, содержащим бактериостатические препараты. Молоко, консервированное генцианвиолетом или другими консервантами, высевают на среды без бактериостатических веществ.

3.4.3. Для выращивания культур посевы помещают в термостат при 37-38 °С.

При исследовании материала от крупного рогатого скота половину засеянных пробирок и чашек культивируют в обычных условиях, другую — в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (10-15%) в -инкубаторе или эксикаторе (микроанаэростате). Аналогичные условия можно создать в пробирках, закрытых резиновыми пробками или залитых парафином.

Перед парафинированием пробирки закрывают ватными пробками, пронося последние над пламенем горелки. Затем верхнюю часть пробки обрезают, а оставшуюся часть углубляют на 0,5-1,0 см внутрь пробирки и заливают расплавленным парафином.

Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:

— заполнения части объема углекислым газом из баллона или аппарата Киппа;

— внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25%-го раствора кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л объема);

— сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора. Для определения концентрации углекислого газа в эксикаторе можно использовать химический метод (см. Прил. N 1, п.3).

3.4.4. Посевы выдерживают в термостате при 37-38 °С в течение 30 сут. Первичный осмотр посевов проводят через 24-48 ч. Пробирки с агаром и бульоном, заросшие посторонней микрофлорой, обезвреживают путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.

В дальнейшем для обнаружения роста бруцелл посевы просматривают каждые 3-4 сут визуально, при необходимости через лупу или малом увеличении микроскопа. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают посевным материалом.

При значительном росте посторонней микрофлоры (80% и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.

При просмотре посевов обращают внимание на характер роста микробов. На поверхности агара бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем свете — сероватый. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.

В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над уровнем бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.

При обнаружении роста на жидких средах и отсутствии характерного роста на агаре из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из специальных методов, и делают пересев на чашки с плотной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках культивируют так же, как и высевы из патологического материала.

Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним из специальных методов — по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на стекле с использованием набора компонентов для серологической дифференциации бруцелл.

Для постановки пластинчатой реакции агглютинации на стекле необходимы следующие компоненты: испытуемая культура, набор для серологической дифференциации бруцелл (выпускается биопредприятием), 0,5%-ный фенолизированный физиологический раствор рН 7,0-7,2.

Для исследования берут двухсуточные агаровые культуры. R- и S-сыворотки бруцеллезные агглютинирующие разводят 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором до рабочего разведения, указанного на этикетке коробки. Разведенные сыворотки допускается использовать в течение месяца. R-антиген бруцеллезный цветной для РА и антиген бруцеллезный для роз бенгал пробы в пластинчатой РА применяют неразведенными. Предметные стекла для реакции подготавливают общепринятым способом. Физиологический раствор, пробирки и пипетки должны быть стерильными.

Техника постановки реакции. На предметное стекло раздельно наносят по одной капле R- и S-сывороток бруцеллезных агглютинирующих и физиологического раствора. Испытуемую культуру бактериологической петлей отдельно эмульгируют в каплях R- и S-сывороток и в капле физиологического раствора для определения самоагглютинации культуры. Параллельно в каждом опыте ставят контроли: R-и S-сыворотки в разведении, указанном на этикетке, с цветным R-бруцеллезным антигеном и с роз бенгал антигеном.

Учет и оценка реакции. Реакцию учитывают невооруженным глазом или с помощью увеличительного стекла в течение 2 минут по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости с образованием четко выраженного агглютината — положительная реакция;

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости с выраженным агглютинатом — положительная реакция;

++ (2 креста) — неполное просветление жидкости со слабо выраженным агглютинатом — положительная реакция;

+ (1 крест) — жидкость без просветления с едва заметным агглютинатом — сомнительная реакция;

— (минус) — просветление жидкости не наступило, смесь гомогенная — отрицательная реакция.

Следует иметь ввиду, что реакция с R-бруцеллезной сывороткой проходит замедленно; агглютинат, как правило, мелкозернистый. Результаты реакции с испытуемой культурой считают достоверными, если в контролях R- и S-бруцеллезных сывороток с гомологичными антигенами агглютинация четко выражена не менее чем 3 креста, а с гетерологичными — отсутствует.

Реакцию с испытуемой культурой считают положительной при наличии агглютинации на 2 креста и более. При отрицательной реакции ее проводят повторно с этой же культурой, взятой из трех-четырех мест посева.

Культуры; обладающие типичными для бруцелл морфологическими, культуральными и тинкториальными свойствами, а также дающие положительную реакцию агглютинации с R- и S-бруцеллезными сыворотками в отдельности или с обеими сыворотками одновременно при отсутствии самоагглютинации в физиологическом растворе, признают бруцеллами.

Культура возбудителя инфекционного эпидидимита баранов и бруцеллеза собак, вызванного В. canis, постоянно агглютинируется только R-бруцеллезной сывороткой.

3.5. Биологическое исследование

3.5.1. Биологическое исследование проводят на морских свинках (не менее двух) массой 350-400 г, предварительно проверенных на бруцеллез исследованием в РА сыворотки крови в разведении 1:5 с отрицательным результатом.

3.5.2. Для постановки биологической пробы используют тот же материал, что и для бактериологического исследования.

Из органов и содержимого желудка абортированного плода готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:10 и вводят морской свинке подкожно с внутренней стороны бедра в объеме 1 мл.

Из плаценты и плодовых оболочек, предварительно обработанных тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором, и подсушенных сухими стерильными тампонами, вырезают кусочки размером 0,5х0,5 см, фламбируют на пламени горелки, растирают в ступке со стерильным песком и заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят морской свинке в объеме 1 мл.

Содержимое гигром, бурс вводят морской свинке подкожно в объеме 0,2-0,3 мл. При этом необходимо учитывать возможность гибели животного от сопутствующей микрофлоры, особенно стрептококков.

Пробы молока центрифугируют 30 мин при 3000 об./мин. Морской свинке вводят подкожно 2-3 мл материала из верхнего слоя (сливки) и осадка молока после центрифугирования.

3.5.3. На 15, 25 и 40-е сут после заражения у морских свинок берут кровь в количестве 1-2 мл из ушной вены путем надреза или из сердца — путем пункции. Сыворотку крови исследуют в пробирочной РА в разведениях от 1:10 до 1:80.

При положительной реакции агглютинации в разведении 1:10 и выше морских свинок убивают. В случае необходимости получения культуры возбудителя материал от них исследуют бактериологически. Высевы делают пастеровскими пипетками в одну пробирку бульона и две пробирки агара из паховых, парааортальных лимфатических узлов (правых и левых), селезенки (2 высева), печени и костного мозга. Посевы культивируют, как описано в подпунктах 3.4.3 и 3.4.4.

При отрицательной РА у морских свинок в указанные выше сроки биопробу считают отрицательной, подопытных животных убивают, бакисследование не проводят.

3.5.4. При выделении культуры бруцелл на питательных средах из исходного материала биологическое исследование по данной экспертизе прекращают, а ранее зараженных морских свинок убивают без бакисследования.

3.6. Результат исследования на бруцеллез считают положительным при выделении культуры возбудителя или при получении у морской свинки положительной РА в разведении сыворотки крови 1:10 и выше, если из исходного материала культура не выделена.

При положительных результатах бактериоскопии и отрицательных результатах бактериологического исследования и биопробы материал считают подозрительным на бруцеллез. При сохранении патматериала или возможности взятия нового (кровь, молоко, моча и др.) исследование проводят методом полимеразной цепной реакции. По ее результатам делают заключение о заболевании животных бруцеллезом.

3.7. Сроки исследования:

— бактериологического — до 1 мес;

— биологического — до 2 мес.

3.8. В ветеринарных лабораториях все выделенные культуры бруцелл после их идентификации подлежат уничтожению путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.

3.9. При необходимости определения вида бруцелл выделенные от животных культуры направляют в республиканские, краевые, областные ветеринарные лаборатории или ветеринарные научно-исследовательские учреждения, в которых имеются лаборатории или отделы, занимающиеся изучением бруцеллеза животных и имеющие разрешение органов здравоохранения на работу с микроорганизмами второй группы.

Читайте также:  Абортированный плод при бруцеллезе

4.1 Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических антител в сыворотке крови животных в реакции агглютинации (РА) в пробирках, реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК), реакции иммунодиффузии с 0-полисахаридным антигеном (РИД), пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба — РБП) и в молоке коров — кольцевой реакции (КР) и других реакциях, утвержденных в установленном порядке.

4.2 Постановка и учет результатов реакции агглютинации (РА) в пробирках

4.2.1 Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, лошадей, верблюдов, оленей (маралов), собак, пушных зверей и морских свинок.

4.2.2 Компоненты реакции агглютинации:

— испытуемые сыворотки крови (см. п.2.3.1);

— позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием;

— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных из опыта или консервированная), изготовленная биопредприятием или полученная в лаборатории;

— антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Прил. N 2, п.6);

— 0,5%-ный фенолизированный раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и антигена используют фенолизированный физиологический раствор хлорида натрия (0,85%-ный); при исследовании крови овец и коз — 5%-ный и оленей (маралов) — фенолизированный 10%-ный раствор хлорида натрия (см. Прил. N 2, п.1).

4.2.3. Постановка реакции агглютинации

Реакцию агглютинации проводят в серологических пробирках в объеме 1 мл в четырех разведениях:

— при исследовании сывороток крови овец, коз, оленей (маралов) и собак — 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200;

— крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

— пушных зверей и морских свинок — 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.

Компоненты реакции вносят индивидуальными мерными пипетками (дозаторами) или групповыми дозаторами Флоринского.

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках первого ряда делают исходное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирку, добавляют к ней 2,4 мл соответствующего раствора хлорида натрия, смешивают и получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови овец, коз, оленей (маралов) и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5). Таким образом, делают исходное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда штатива (по 10 проб в ряду).

После приготовления исходного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского или индивидуальных пипеток-дозаторов переносят в пробирки второго и третьего рядов по 0,5 мл исходного разведения сывороток (1:25; 1:12,5 или 1:5). В пробирках третьего ряда сыворотки смешивают, по 0,5 мл этого разведения переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда — в пятый. Из пробирок пятого ряда 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом, делают последовательные двукратные разведения сывороток.

После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разведенного 1:10 соответствующим раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сыворотки в каждой пробирке удваивается и, в зависимости от вида исследуемых животных, будет составлять 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, они служат контролем качества сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.

При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей) или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл при исследовании сывороток овец, коз, оленей (маралов) и собак. Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена, разведенного соответствующим раствором хлорида натрия 1:20. При этом разведения сывороток будут соответственно 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят контроли с негативной и позитивной бруцеллезной сыворотками в таких же разведениях.

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при 37-38 °С на 16-20 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.

4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки до и затем, после легкого встряхивания, оценивают в крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости, микробные клетки антигена осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик» (75% агглютинации);

++ (2 креста) — неполное просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен (50% агглютинации);

+ (1 крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик» выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25% агглютинации);

— (минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» не наступило, на дне пробирки по центру образуется небольшой осадок микробов антигена в виде точки или пятна. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимается вверх в виде косички и равномерно распределяется в жидкости, которая при этом приобретает первоначальную мутность.

За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц (ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с титром 1:100 содержит 100 ME, 1:200 — 200 ME и т.д.).

Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности, соответствующие 75, 50, 25 и 0% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания пробирок из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по 0,5 мл физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50 и 25% просветления жидкости. В четвертой пробирке просветление отсутствует. Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.

При массовых исследованиях в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.

4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сывороткой крови крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), верблюдов и лошадей, не иммунизированных или иммунизированных неагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами (см. Прил. N 2, п.7), содержащей 200 ME антител и выше; овец и коз — 100 ME и выше; оленей (маралов) и собак — 50 ME и выше; пушных зверей и морских свинок — 10 ME и выше.

При выявлении среди не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, а также иммунизированных неагглютиногенными вакцинами крупного рогатого скота, верблюдов и лошадей, животных, реагирующих только в РА с содержанием антител 50-100 ME, а среди овец, коз, оленей (маралов), собак — 25 ME, считают сомнительно реагирующими и исследуют повторно через 15-30 сут. При повышении титров заболевание считают установленным. При сохранении титров на прежнем уровне проводят дополнительные исследования по дифференциации, согласно утвержденным методам.

При выявлении в стадах крупного рогатого скота, ранее иммунизированного против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами (см. Прил. N 2, п.7), животных, реагирующих только в РА с содержанием не выше 200 ME антител и РСК в разведении сыворотки крови не выше 1:10, их повторно исследуют через 15-30 сут в РА, РСК и РИД. При повышении содержания антител в исследуемых сыворотках в РА и (или) РСК или положительной РИД заболевание считают установленным.

При выявлении в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота, ранее не иммунизированных или иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, животных, положительно реагирующих в РА с содержанием 100 ME антител и выше, признают больными. Реакцию считают сомнительной при содержании 50 ME антител. Сыворотки крови от таких животных через 15-30 сут исследуют повторно. При получении вновь сомнительного результата животных признают больными бруцеллезом.

При исследовании в РА неиммунизированных баранов-производителей, козлов, пробников и ярок, содержащихся в благополучных по бруцеллезу отарах, где овцы (козы) иммунизированы против бруцеллеза, реакцию считают положительной, а заболевание установленным при содержании в сыворотке крови животных 100 ME антител и выше. Реакцию считают сомнительной при наличии 50 ME антител. Сыворотки крови от таких животных через 15-30 сут исследуют повторно. При получении вновь сомнительных результатов животных признают здоровыми, а отару — благополучной по бруцеллезу.

В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженный в международных единицах (например: титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:200 с оценкой 2-4 креста — «положительная» 200 ME; титр сыворотки 1:100 с оценкой 2-4 креста — «сомнительная» 100 ME).

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его годности, а также титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических исследований.

4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК)

4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов), собак и пушных зверей.

Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо РСК при исследовании на бруцеллез сывороток крови животных.

4.3.2. Компоненты реакции и их подготовка к работе:

— испытуемые сыворотки крови (см. п.2.3.1);

— позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от больного бруцеллезом животного;

— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных из опыта или консервированная), изготовленная на биопредприятии или полученная в лаборатории.

Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной бане в день постановки реакции: для РСК — при 60-62 °С в течение 30 мин (сыворотки крови ослов и мулов — 64-65, буйволов — 62-64, свиней — 58-60 °С); для РДСК — сыворотки крови животных всех видов — при 63-64 °С в течение 30 мин;

— антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК в рабочем титре, указанном биопредприятием-изготовителем (см. Прил. N 2, п.6);

— комплемент — сыворотка крови морской свинки, лиофильно высушенная, биофабричного изготовления или нативная (свежая или консервированная добавлением 2-4% борной кислоты).

Сухой биофабричный комплемент растворяют физиологическим раствором, как указано на этикетке коробки. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для проведения всего опыта количество комплемента. В каждую ампулу (флакон) вносят физиологический раствор и, не встряхивая, помещают в холодильник на 20-30 мин. Растворившийся комплемент осторожно перемешивают путем легкого встряхивания ампул (флаконов), сливают в одну пробирку, смешивают и помещают в холодильник при 4-10 °С. Непосредственно перед внесением в пробирки для титрования растворенный или нативный комплемент разводят физиологическим раствором 1:20, а остальной — хранят в холодильнике для постановки главного опыта. Рабочее разведение комплемента также готовят непосредственно перед внесением в пробирки главного опыта;

— гемолитическая сыворотка (гемолизин) — сыворотка крови кролика, гипериммунизированного эритроцитами барана, — для РСК и РДСК в удвоенном титре. Титрование гемолизина проводят при использовании каждой новой серии и по истечении срока годности (см. Прил. N 2, п.5);

— эритроциты барана — 2,5%-ная от осадка взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе для РСК и РДСК (см. Прил. N 2, п.3).

Для приготовления гемолитической системы взвесь эритроцитов и раствор гемолизина в рабочем разведении смешивают в равных объемах и при постановке РСК выдерживают в водяной бане при 37-38 °С в течение 15-20 мин при периодическом перемешивании, а при постановке РДСК — в холодильнике. При смешивании компонентов раствор гемолизина вливают во взвесь эритроцитов;

— физиологический раствор — 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде с рН 6,8-7,2 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и кальция (см. Прил. N 2, п.2). Последний в обязательном порядке готовят в случае использования нативного комплемента (свежей или консервированной сыворотки крови морской свинки).

Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции и при необходимости проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:

источник