Меню Рубрики

Кольцевая проба молока на бруцеллез

Основными тестами при массовых диагностических исследованиях явля­ются пробирочная РА, РА на стекле (Роз-бенгал проба), РСК и РДСК, коль­цевая реакция с молоком, реакция диффузионной преципитации.

Пробирочная реакция агглютинации.Используют при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота, шец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей, собак, пушных зверей И т.д. Реакцию проводят в объеме
1 мл. Сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов исследуют в разведениях 1:50-1:400; онец, коз, свиней, буйволов, оленей и собак — 1:25 -1:200; пушных зве­рей и морских свинок — 1:10-1:80. При массовых исследованиях до­пускается постановка РА в двух первых разведениях, но при этом надо иметь в виду возможность феномена «прозоны». Сыворотки крови круп­ного рогатого скота, лошадей, собак, пушных зверей, верблюдов разво­дят 0,85%-ным раствором натрия хлорида с 0,5% фенола; сыворотки кро­ви овец, коз и буйволов разводят 5%-ным, а сыворотки крови оленей — 10%-ным фенолизированным раствором натрия хлорида. Разведения сы­воротки крови делают в объеме 0,5 мл, затем в каждую пробирку вносят 0,5 мл единого бруцеллезного антигена, разведенного 1:10, при этом раз­ведения сыворотки крови удваиваются. Компоненты перемешивают Встряхиванием и штатив с пробирками помещают в термостат при 37-38° С на 18-20 часов, затем выдерживают несколько часов при комнат­ной температуре и учитывают результат общепринятым способом (техни­ку постановки и учета результатов РА см. в разделе «Серологические ре­акции»). В качестве контролей параллельно исследуют заведомо положи­тельную и отрицательную сыворотки. РА при бруцеллезе крупного рога­того скота, лошадей и верблюдов считают положительной при титре 1:100 и более (1:50 — сомнительный результат), у овец, коз, оленей, буйволов и собак — 1:50 (1:25 — сомнительный результат). При получении сомни­тельных результатов сыворотки крови от этих животных исследуют через три-четыре недели повторно.

Помимо титра результаты пробирочной РА выражают в международ­ных единицах (ME). В разных странах готовят антигены, различающиеся по агглютинабилыюсти, что приводит к несопоставимости титров РА. По­этому была предложена международная стандартная бруцеллезная сыво­ротка, по отношению к которой определяют активность национальных ан­тигенов. Активность стандартной сыворотки определена в 1000 МЕ/мл. Например, при исследовании этой сыворотки с определенным нацио­нальным антигеном она показывает в РА титр 1:500. Следовательно, если в РА с этим антигеном исследуют сыворотку крови от животного из хозяй­ства и получают титр РА 1:500, то она также содержит 1000 ME бруцеллез­ных антител, а вторая сыворотка, давшая титр 1:400, содержит 1000 х 400 : 500 = 800 ME и т.д. В настоящее время в странах разработаны национальные стандартные бруцеллезные сыворотки, соответствующие по активности международной сыворотке. В РФ в соответствии с «Наставлением по диаг­ностике бруцеллеза животных» (2000) приняты следующие критери оценки РА в ME. Реакцию считают положительной у невакцинироваппого крупного рогатого скота, верблюдов, лошадей, а также иммунизированных неаг-глютиногенными вакцинами при наличии 200 ME антител (сомнительной — 50-100 ME); у овец и коз — 100 ME; оленей и собак — 50 ME; пушных зверей и морских свинок —10 ME. PA считают сомнительной у овец, коз, оленей, собак этой группы на уровне 25-50 ME. При сомнительных пока­заниях РА животных повторно исследуют через 15-30 суток. В случае повышения уровня антител животных признают больными, при отсутствии динамики — здоровыми. Выявление в стадах крупного рогатого скота, иммунизированного ра­нее агглютиногенными вакцинами, животных с уровнем антител не более 200 ME предполагает через 15-30 суток их повторное исследование. Если при повторном исследовании наблюдают повышение уровня антител, то животных признают больными. При отсутствии повышения дополнитель­ными методами уточняют специфичность результатов РА.

При обнаружении в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота (ранее иммунизированного или не иммунизированного) жи­вотных с уровнем антител 100 ME и более их признают больными,
50 ME — результат РА сомнительный. В случае сомнительной РА животных исследу­ют через 15-30 суток повторно и при вторичном сомнительном результате животных признают больными.

При исследовании в РА невакцинированных баранов-производителей, пробников, ярок, козлов, содержащихся в благополучных отарах, где про­водилась иммунизация, РА оценивают как положительную при уровне ан­тител 100 ME и более, сомнительной — 50 ME. В последнем случае живот­ных через 15-30 суток исследуют повторно, и, если содержание антител не увеличилось, их признают здоровыми.

Роз-бенгал проба (РБП).РА на стекле с корпускулярным антигеном, окрашенным розовым бен­гальским, используют для диагностики бруцеллеза крупного рогатого ско­та, овец, коз, лошадей, свиней, буйволов, верблюдов и северных оленей. Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре не ниже 18°С. Исследуемые сыворотки в дозе 0,03 мл вно­сят на дно лунки, затем в лунку рядом с сывороткой помещают при исследо­вании крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов и свиней 0,03 мл ан­тигена, сывороток овец, коз, буйволов и северных оленей — 0,015 мл анти­гена. Компоненты должны иметь температуру не ниже 18°С.

Затем компоненты перемешивают в течение 4 минут, одновременно учи­тывая результат. В положительных случаях в течение указанного времени появляются розовые хлопья агглютината. В РБП исследуют неразведен-ные сыворотки, влияние нормальных антител нивелируется использовани­ем кислого антигена со значениями рН, при которых нормальные антитела с низкой авидностыо не реагируют с антигеном, что обеспечивает специ­фичность результата реакции. Перед началом исследований антиген проверяют в РБП на активность, специфичность и на спонтанную агглютинацию соответственно с позитивной, негативной сыворотками и в последнем случае — с физиологическим раствором. В соответствии с «Наставлением по диагностике бруцеллеза животных» в РФ результат РБП считают положительным при наличии четко выраженной агглютинации. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах в случае позитивной РБП сыворотки крови исследуют в РА и РСК (РДСК) или РА и РИД. Если при этом получают отрицательные результаты, то животных с позитивной РБП повторно исследуют через 15-30 дней в этих же серологических реакциях. В неблагополучном по бруцеллезу хозяйствах овец, коз, северных оленей с позитивной РБП признают больными. Сыворотку крови крупного рогатого скота, вер­блюдов и лошадей дополнительно исследуют в РА, РСК (РДСК) или РА и РИД, животных с положительными результатами этих серологических ре­акций признают больными, сомнительно реагирующих исследуют повторно через 15-30 суток в РА, РСК (РДСК) или РА и РИД. При получении положительных или сомнительных результатов животных признают больными бруцеллезом.

Кольцевая реакция с молоком (КР).Реакцию применяют для проверки благополучных по бруцеллезу стад крупного рогатого скота и молока на рынках.

В РФ, в соответствии с «Наставлением по диагностике бруцеллеза животных», реакцию и оценку результатов проводят следующим образом. В уленгутовские пробирки наливают 0,05 мл антигена (клетки бруцелл, окрашенные гематоксилином) и 1 мл исследуемого молока. Если используют пробирки Флоринского — 2 мл молока и 0,1 мл антигена, компоненты пе­ремешивают, пробирки помещают в водяную баню (37-38° С) на 1 час, затем учитывают результат по нижеследующим критериям:

«+++» Четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, молоко белое Результат положительный
«++» Достаточно выраженное синее кольцо в слое сли­вок, остальная часть молока имеет синеватый цвет Результат положительный
«+» Синее кольцо в слое сливок выражено слабо, столбик молока имеет синий цвет Результат сомнительный
«-» Столбик молока равномерно окрашен в синий цвет, слой сливок белого или желтоватого цвета Результат отрицательный

КР на 2-3 креста считают положительной, 1 крест — сомнительной. При положительной КР от всех животных стада берут кровь для исследо­вания в РА или РСК (РДСК) или РА и РИД. Если получают их отрицатель­ный результат, то независимо от позитивной КР животных признают здоро­выми.

Реакция связывания комплемента (РСК, РДСК). Данную серологическую реакцию применяют для диагностики бруцел­леза практически у всех видов животных. Согласно «Наставлению по ди­агностике бруцеллеза животных» исследуемые сыворотки крови крупного рогатого скота для РСК инактивируют разведенными 1:5 в водяной бане в течение 30 минут при 60-62°С; сыворотки крови ослов, мулов при 64-65°С; буйволов — 62-64° С; свиней — 60-62° С 50 минут; при постанов­ке РДСК 30 минут при 62-64° С. Используют единый бруцеллезный анти­ген в рабочем титре, гемолизин для РСК в удвоеном титре, для РДСК — в утроенном, 2,5%-ную взвесь эритроцитов барана для РСК и 3%-ную для РДСК. Комплемент в количестве 1,2 единицы (титр комплемента принима­ется за 1 единицу). Реакцию проводят в объеме 1 мл с сыворотками, разве­денными 1:5 или 1:10 (технику постановки и учета результатов см. в разде­ле «Серологические реакции»).

При исследовании сывороток в одном разведении (1:5) и задержке гемо­лиза на один крест эти сыворотки повторно исследуют в двух разведениях (1:5, 1:10). В случае сомнительной РСК животных повторно исследуют че­рез 15-30 суток. Если при повторном исследовании животных из благопо­лучного по бруцеллезу хозяйства вновь получена сомнительная РСК — жи­вотных признают здоровыми. Если аналогичный результат получен у жи­вотных неблагополучного хозяйства, их рассматривают как больных. По­лучение только позитивной РСК в разведении 1:10 в благополучных по бруцеллезу стадах ранее вакцинированного крупного рогатого скота пред­полагает повторное исследование через 15-30 суток. При нарастании титров РСК диагноз на бруцеллез считают установленным, в обратном слу­чае результат исследования считают отрицательным («Наставление по ди­агностике бруцеллеза животных», 2000).

Реакция иммунодиффузии (РИД). Согласно «Наставлению по диагностике бруцеллеза животных» (2000) в РФ РИД используют при плановых исследованиях в благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах, где не применяются вак­цины, одновременно с РА, а также при проверке сомнительно реагирую­щих в РА или РСК (РДСК) животных для дифференциации неспецифичес­ких реакций; в благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах, где проводится иммунизация крупного рогатого скота аг-глютиногенными вакцинами при контроле эпизоотического состояния (не ранее 1,5 месяца после вакцинации); для дифференциации реакций, полу­ченных в РА (не более
200 ME) или РСК (РДСК) в разведениях не выше 1:10; при плановых исследованиях животных одновременно с РА; в не­благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах через 1,5 месяца после иммунизации; среди телок и нетелей в течение первых шести месяцев после иммунизации (реиммунизации) 2-4-кратно; через месяцев после иммунизации (реиммунизации) животных для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе предусмотренных реакций; при постановке хозяйства на контроль и снятии ограничений одновременно с РА и РСК (РДСК).

При диагностике бруцеллеза северных оленей для оценки эпизоотического состояния стад, благополучных по бруцеллезу, вакцинированных против бруцеллеза; для исследования на бруцеллез не ранее чем через два месяца после применения вакцин; для дифференциации неспецифических реакций.

Техника проведения РИД. Расплавленный агар разливают по 2,5 мл на предметные стекла, пластинки размером 6×9 см —12 мл, стандартные чашки Петри слоем не менее 2 мм, которые предварительно размещают на строго горизонтальной поверхности. В застывшем агаровом геле штампом делают лунки: центральную диаметром 5 мм и шесть переферических по 3 мм.

В центральную лунку вносят 20 мкл О-полисахаридного антигена, в пе­риферические — 40 мкл исследуемых сывороток крови. Одновременно на каждой пластинке (чашке Петри) ставят контроль с позитивной сывороткой крови. Затем стекла (чашки Петри) выдерживают во влажной камере при температуре не ниже 18° С и учитывают результат в косопроходящем свете через 24 и 48 часов. Как положительный результат оценивают наличие ли­нии преципитации, появившейся через 24 часа. Сыворотки крови, давшие реакцию преципитации через 48 часов, исследуют повторно и при получении линии преципитации через 24 или 48 часов результат реакции признают по­ложительным.

Печеночно-сывороточный или печеночно-аминопептидный агар.Готовят печеночный отвар: 500 г свежего фарша говяжьей печени смешивают с 500 мл воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр, стерилизуют в автоклаве, смешивают равные объемы печеночного отвара и водопроводной воды, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2% агар-агара. На 1000 мл смеси вносят 17 мл 10%-ной двууглекислой соды, автоклавируют 20-25 минут при 115° С, фильтруют через ватный фильтр, ус­танавливают рН 7,0-7,2, добавляют 1% глюкозы и 2% глицерина, разливают по колбам и стерилизуют 20-25 минут при 110° С. Перед использо­ванием агар расплавляют, остужают до 50° С, добавляют 10-20% сыво­ротки крови лошади или крупного рогатого скота (печеночно-сывороточ-иый агар) или 10-15% аминопептида (печеночно-аминопептидный агар) и разливают по чашкам или пробиркам. Также готовят полужидкие агары, внося 0,15-0,2% агар-агара. Рекомендуют среды данного типа для культивирования В. ovis.

Печеночный агар Хеддльсона.В 500 мл воды вносят 10 г пентона,
5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара, автоклавируют 30 минут, добавляют 500 мл печеночного отвара, охлаж­дают до 60° С, устанавливают рН 7,0. К 1 л среды добавляют один яичный белок, автоклавируют 30 минут при 120° С, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН 7,0, разливают по емкостям и стерилизуют 30 минут при 115° С.

Плотный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (ППГГА). 400 г свежей говяжьей печени освобождают от жира и пленок, измель­чают, добавляют 500 мл водопроводной воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр. Полученный печеночный отвар разводят водопро­водной водой 1:1, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2,5% ага­ра и
17 мл 10%-ного раствора гидрокарбоната натрия на 1000 мл. Среду автоклавируют 20 минут при 115° С, отстаивают в автоклаве 3-4 часа, фильтруют через ватный фильтр, устанавливают рН 7,2. Затем в среду вно­сят 1% глюкозы и 2-3% глицерина, разливают по пробиркам, колбам, сте­рилизуют 20-25 минут при 110° С. Данную среду рекомендуется приме­нять для культивирования В. abortus, В. melitensis и В. suis, при бактериостатическом методе дифференциации бруцелл. ППГГБ готовят так же, но агар не добавляют.

Сывороточно-декстрозиый агар.К 835 мл дистиллированной воды добавляют 15г агар-агара, 10г пептона, 5 г химически чистого натрия хлорида и 165 мл мягкой воды. Прогре­вают 1 час текучим паром, устанавливают рН 7,8, автоклавируют 30 мин при 127° С, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,4. Среду разливают по сосудам и стерилизуют при 116° С 15 минут. Перед использованием среду расплавляют, охлаждают до 50° С, добавляют сте­рилизованные фильтрованием сыворотку крови лошади или крупного ро­гатого скота до концентрации 5% и раствор декстрозы до уровня 1%. Сре­да рекомендуется для первичного выделения бруцелл.

Сывороточно-декстрозный бульон.Готовят так же, как сывороточно-декстрозный агар, но без добавления агар-агара.

Альбими-агар.В 1000 мл дистиллированной воды добавляют 20 г сухого пептона, 20 мл дрожжевой воды, 5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,3, все компоненты растворяют в аппарате Коха, фильтруют через ватный фильтр. Вносят 1 г глюкозы, 0,2 г бисульфита натрия, устанавливают рН 7,2 0-7,3, разливают по колбам и стерилизуют 40 минут текучим паром, затем 20 минут в автоклаве при 110° С. Дрожжевую воду получают путем кипячения 1 кг хлебных дрожжей в 1000 мл дистиллированной воды, затем фильтруют через полотно и хранят под флороформом в темноте (не более 15 дней).

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Применяется КР с целью проверки благополучия стад на бруцеллез крупного рогатого скота и для проверки молока при продаже его на рынках.

Компонентами реакции являются:

— антиген цветной бруцеллезный для кольцевой реакции с молоком, который представляет собой стандартизованную взвесь убитых бруцелл, окрашенных гематоксилином в синий цвет;

— сыворотка позитивная бруцеллезная.

В агглютинационные пробирки берут по два мл молока и добавляют по 0,1 мл антигена, затем пробирки тщательно встряхивают для перемешивания молока с антигеном.

При каждой постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами молока ставят контроли: с молоком от заведомо здоровой коровы; со смесью молока здоровой коровы и позитивной бруцеллезной сыворотки (0,05 мл сыворотки на 1 мл молока). Штативы с испытуемыми и контрольными пробами молока помещают в водяную баню или термостат при 37-38°С на 1 час. Если в молоке имеются бруцеллезные антитела, то они образуют с антигеном комплекс, который адсорбируется на капельках жира и при отстаивании всплывают вверх, образуя синее кольцо (остальная часть молока остается белой) – реакция положительная.

При отрицательной реакции столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий цвет, который был получен сразу после добавления к нему антигена, а слой сливок – белого или слегка желтоватого цвета.

Рис. 67. Капельная реакция агглютинации на предметном стекле: а – положительная; б – отрицательная

При получении положительного или сомнительного результата КР от всех животных берут кровь для исследования на бруцеллез в РБП или РА и РСК (РДСК), проводят эпизоотологическое обследование хозяйства, клинический осмотр и исследование животных на заболевание маститами.

К а п е л ь н ы й м е т о д РА применяют в основном для идентификации культур бактерий, а также для установления их принадлежности к определенным серогруппам и серовариантам. Так поступают при диагностике колибактериоза и сальмонеллезов. Техника постановки РА сводится к следующему. На предметное стекло наносят каплю сыворотки и каплю физиологического раствора (контроль). Петлю с бактериальной культурой увлажняют в капле сыворотки, затем культуру тщательно растирают рядом с каплей, смешивают с сывороткой и энергично 6-10 раз покачивают стекло круговыми движениями. Агглютинация наступает сразу или не позднее 1-2 мин. Реакцию агглютинации учитывают при хорошем освещении. Пользование лупой облегчает учет реакции.

Агглютинация проявляется в виде склеивания бактериальной массы и полного или частичного просветления жидкости.

При отрицательной реакции культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки образует гомогенную взвесь (рис. 67). То же самое должно быть при проведении контроля (антиген + физиологический раствор).

Р о з-б е н г а л п р о б а (РБП)

Пластинчатую реакцию агглютинации с бруцеллезным роз-бенгал антигеном применяют для исследования сывороток крови при диагностике бруцеллеза у многих видов животных.

Компонентами РБП являются:

— испытуемые сыворотки крови;

— бруцеллезный антиген для РБП, изготовляемый на биопредприятиях, представляет собой стандартизированную суспензию в буферном растворе инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл, окрашенных бенгальским розовым в розовый цвет;

— позитивная бруцеллезная и негативная сыворотки;

— 0,5%-ный карболизированный физиологический раствор.

Реакцию проводят на чистых сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре 18-30°С.

Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки. При исследовании сывороток крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, свиней в каждую лунку рядом с сывороткой вносят 0,03 мл антигена, а при исследовании сывороток других животных – 0,015 мл, тщательно смешивают покачиванием и легким вращением в течение 4 мин. Одновременно проводят контроли антигена с позитивной и негативной сыворотками, с физраствором.

Реакцию считают положительной при выраженной агглютинации окрашенных бруцелл в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета, выделяющихся на белом фоне лунки. Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенна, равномерно окрашена).

Р е а к ц и я г е м а г г л ю т и н а ц и и (РГА)

Эта реакция не относится к реакциям иммунитета, так как является результатом действия естественных гемагглютининов некоторых бактерий и вирусов на эритроциты, что влечет за собой их агглютинацию.

Реакцию ставят на плексигласовых панелях с лунками.

Исследуемый материал разводят физраствором и к этим разведениям добавляют равный объем 1-2%-ной взвеси эритроцитов, после чего панели с реакцией помещают в термостат на 30 мин или оставляют при комнатной температуре на 1 ч.

Учет реакции производят по характеру осадка. При положительной реакции осадок из склеившихся эритроцитов имеет форму раскрытого «зонтика» с изрезанными краями, а при отрицательной — компактный диск в виде «кнопки» с ровными краями.

Реакция гемагглютинации позволяет только выявить гемагглю-тинирующую способность бактерий и вирусов.

Для идентификации этих микроорганизмов в дальнейшем используют реакцию торможения гемагглютинации.

Р е а к ц и я т о р м о ж е н и я г е м а г г л ю т и н а ц и и (РТГА)

РТГА – иммунная реакция, в которой специфические антитела, взаимодействуя с антигеном, лишают его способности агглютинировать эритроциты.

Реакция проводится в два этапа. На первом этапе разводят специфическую сыворотку от 1:10 до 1:1280, К каждому разведению сыворотки добавляют равный объем жидкости, содержащий антиген в четырехкратном титре, который определен в РГА. Если титр антигена равен 1:640, агглютинируют эритроциты, делают разведение в 4 раза концентрированнее – 1:160.

После инкубирования при 37°С в течение 30 мин на втором этапе к этой смеси добавляют равный объем 1-2%-ной взвеси эритроцитов. Если сыворотки и антигена взято по 0,25 мл, то эритроцитов добавляют 0,5 мл.

Контролем является проба, где сыворотка заменена физраствором. Реакция читается после выдерживания в течение 30 мин в термостате или 45 мин при комнатной температуре.

При положительной РТГА образуется плотный осадок эритроцитов (задержка реакции) на дне пробирки, имеющих вид «пуговки» диска.

При отрицательной РТГА отмечается выраженная гемагглютинация в виде «зонтика».

Реакция используется для идентификации и типизации выделенного антигена, титрования вируссодержащих жидкостей и материалов и серологическом диагностики вирусных инфекций.

Р е а к ц и я н е п р я м о й (п а с с и в н о й) г е м а г г л ю т и н а ц и и (Р Н Г А)

Сущность этой реакции заключается в том, что на поверхность эритроцитов адсорбируют или антиген, или антитела (иммуноглобулины), которые приобретают способность агглютинироваться в присутствии специфических антител или антигена.

Главными достоинствами РНГА – высокая чувствительность и специфичность, техническая простота, стабильность используемых компонентов.

РНГА применяют при диагностике инфекционных болезней:

1) для обнаружения в титрования антител в исследуемой сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;

2) для идентификации неизвестного антигена с помощью известного иммуноглобулинного эритроцитарного диагностикума.

Учет РНГА проводится так же, как и при постановке РГА.

Задания для самостоятельной работы

1. Провести постановку и учет результатов реакции агглютинации капельным методом с неизвестным антигеном с использованием набора агглютинирующих сальмонеллезных сывороток.

2. Провести постановку реакции агглютинации классическим (пробирочным методом) на бруцеллез с сыворотками крови крупного рогатого скота (учет результатов провести на следующем занятии).

3. Ознакомиться с результатами кольцевой реакции с молоком на бруцеллез, с реакцией гемагглютинации с Роз-бенгаловой пробой на бруцеллез.

Вопросы для самоподготовки и контроля знаний

1. Как называются компоненты в реакции агглютинации?

3. Осадок, продукт соединения антигена с антителом.

2. Для постановки реакции агглютинации необходимо приготовить исходное разведение исследуемой сыворотки 1:25. Какой из приведенных вариантов удовлетворяет это условие?

А. 0,3 мл сыворотки + 4,7 мл физраствора.

Б. 0,2 мл сыворотки + 4,8 мл физраствора.

В. 0,1 мл сыворотки + 4,9 мл физраствора.

3. При чтении реакции агглютинации в одной из пробирок установлены следующие признаки – жидкость мутная (непрозрачная), на дне небольшой осадок. Дать оценку реакции агглютинации на плюсовой системе.

4. При чтении реакции агглютинации на бруцеллез с сывороткой крупного рогатого скота получены результаты:

1:50 +++, 1:100 +++, 1:200 ++, 1:400 ++. Дайте оценку реакции.

5. В лабораторию присланы пробы сыворотки крови крупного рогатого скота. Какие разведения сыворотки нужно приготовить для постановки реакции агглютинации на бруцеллез?

6. Какие изменения претерпевает антиген под действием специфических антител в реакции агглютинации?

А. Выпадает осадок на границе обеих жидкостей.

7. При положительной реакции агглютинации в пробирке наблюдается осадок в виде «зонтика», при встряхивании которого образуются крупные хлопья. К какому виду агглютинации относится данная реакция?

8. Проведена реакция агглютинации методом кольцевой пробы с молоком на бруцеллез, в результате чего проба молока стала белой и на его поверхности образовалось синее кольцо. Дайте оценку реакции.

источник

При исследовании молока кольцевой пробой на бруцеллез в пробирку диаметром 5 — 8 мм наливают 1 мл молока и 1 каплю цветного бруцеллезного антигена (взвесь бруцелл, окрашенных гематоксилином) и ставят ее в термостат при температуре 37 град. C на 40 — 45 минут. Положительная реакция характеризуется появлением в верхнем слое жидкости кольца синего цвета, при сомнительной реакции слабо окрашенное синеватое кольцо, а при отрицательной — никаких изменений не наступает.

ФАЛЬСИФИКАЦИЯ МОЛОКА И МЕТОДЫ ЕЁ ВЫЯВЛЕНИЯ

Контроль пастеризации молока

Проба на пероксидазу:

В пробирку наливают 5 мл пастеризованного молока, добавляют 5 капель р-ра крахмального КСl и 5 капель 0,5 % р-ра перекиси водорода. Содержимое перемешивают. Если цвет содержимого пробирки не изменился, то молоко пастеризовано правильно. Окрашивание содержимого пробирки в синий цвет показывает, что молоко пастеризовано с нарушением режима или к правильно пастеризованному молоку добавлено сырое молоко.

Лактоальбуминовая проба:

Используется для установления пастеризации при температуре выше 80 °С.

В колбе смешивают 5 мл пастеризованного молока и 20 мл воды, добавляют 3 мл 0,1 н р-ра серной кислоты для осаждения казеина и отфильтровывают. В пробирку вносят 5 мл фильтрата и кипятят. Если молоко пастеризовано при 80 °С, то при его кипячении не образуется хлопьев альбумина, а при охлаждении фильтрата не будет осадка.

Определение добавления воды в молоко

Для установления наличия добавленной воды по нейтральной пробе в пробирку наливают 1,5-2см3 концентрированной химически чистой серной кислоты. К такому же количеству контролируемого молока прибавляют одну каплю формалина и перемешивают. Молоко осторожно наливают по стенке в пробирку с серной кислотой. При наличии в молоке воды на границе соприкосновения кислоты и молока образуется сине-фиолетовое кольцо. В натуральном молоке такого кольца не будет.

Читайте также:  Актриса умерла от бруцеллез

Определение примеси соды ГОСТ 24065-80

Примесь соды в молоке и молочных продуктах определяют путем добавления к 3-5 мл исследуемого молока или молочного продукта такого же количества 0,2%-кого спиртового раствора розоловой кислоты. При наличии соды содержимое в пробирке окрашивается в розово-красный цвет, а при отсутствии — в оранжевый.

Определение примеси крахмала

Фальсификацию молокакрахмалом определяют путем добавления в пробирку с 5 мл хорошо перемешанного молока (сметаны, сливок) 2-3 капель люголевского раствора. Содержимое пробирки тщательно взбалтывают. Появление через 1-2 минуты синей окраски указывает на присутствие в исследуемой пробе крахмала.

ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНАЯ ЭКСПЕРТИЗА

КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

Продукты, получаемые из молока в результате молочнокислого брожения (иногда с участием спиртового брожения), называются кисломолочными. Различают продукты, получаемые в результате только молочнокислого брожения (1-я группа) — ряженка, простокваша различных видов, ацидофильное молоко, творог, сметана, йогурт, и продукты, получаемые при смешанном молочнокислом и спиртовом брожении (2-я группа) — кефир, кумыс и др. Продукты 1-й группы имеют достаточно плотный, однородный сгусток и кисломолочный вкус, обусловленный накоплением молочной кислоты. Продукты 2-й группы обладают кисломолочным освежающим, слегка щиплющим вкусом, обусловленным присутствием этилового спирта и углекислоты, и нежным сгустком, пронизанным мельчайшими пузырьками углекислого газа. Сгусток этих продуктов легко разбивается при встряхивании, благодаря чему продукты приобретают однородную жидкую консистенцию, поэтому их часто называют напитками.

При производстве кисломолочных продуктов применяют чистые культуры молочнокислых бактерий. В зависимости от вырабатываемых продуктов в состав чистых культур входят молочнокислый стрептококк (Str. lactis), болгарская палочка (Васt. bulgaricum), ацидофильная палочка (Васt. аcidophilum), ароматообразующие бактерии (Str. diacetilactis) и молочные дрожжи (Тorula). Каждый продукт изготовляется с помощью определенных культур микроорганизмов.

Основные биохимические процессы, протекающие при получении кисломолочных продуктов, таковы: молочнокислое и спиртовое брожение молочного сахара, коагуляция казеина и гелеобразование; в результате этих процессов формируются консистенция, вкус и запах готовых продуктов.

Кисломолочные продукты тщательно перемешивают. Для всех продуктов объем средней пробы составляет 50 мл (за исключением сметаны и сливок – 15 г, творог – 20 г). Во всех случаях исследуют органолептически и выборочно содержание жира и кислотность. При необходимости выявляют фальсификацию и контролируют режим (пастеризации или кипячения). Продукт исследуют не позднее 4 часов после отбора. Для отбора используют трубчатые и цилиндрические пробоотборники.

Рисунок 2 – Пробоотборники для сливочного масла, творога и сметаны

Методика оценки качества кисломолочной продукции:

Органолептика: Простокваша должна иметь вкус и запах чистые, кисломолочные, без посторонних, не свойственных продукту привкусов и запахов, в простокваше южной допускается спиртовой привкус, в варенце и ряженке – привкус пастеризации. Цвет молочно-белый, у ряженки и варенца – с буроватым оттенком. Сгусток в меру плотной, ненарушенный, без газообразования, на поверхности допускается незначительное выделение сыворотки, на изломе сгусток глянцевидный, устойчивый, для варенца и ряженки допускается наличие молочных пенок, для ацидофильной и южной – слегка тягучий. Не допускается к приемке простокваша с пустотами, дряблую, вспученную, загрязненную, с кормовым, горьким вкусом и запахом. Кислотность простокваши 80-1100Т, южной – 90-1400Т, ряженки 75-1000Т.

Кефир должен иметь вкус чистый, кисломолочный, освежающий, слегка острый, специфический, без посторонних привкусов и запахов. Консистенция однородная, наполняющая жидкую сметану. Допускается газообразование в виде отдельных глазков, не более 2% отделившейся сыворотки. Кислотность 85-1200Т не допускается к приемке кефира с горьким, аммиачным, кормовым и другими привкусами и запахами, а также грязный.

По качеству творог делят на высший и 1-й сорта. Творог высшего сорта должен иметь вкус и запах чистые, нежные, кисломолочные, без посторонних привкусов и запахов. Консистенция нежная, допускается неоднородная. Цвет белый, слегка желтоватый, с кремовым оттенком, равномерный по всей массе. В 1-м сорте допускаются слабовыраженные привкусы кормов, тары и наличие слабой горечи. Консистенция рыхлая, мажущаяся, а для обезжиренного творога – с незначительным выделением сыворотки, рассыпчатая кислотность жирного творога высшего сорта не более 200 0 Т, полужирного – 210 0 Т, нежирного – 220 0 Т. Пороками творога являются кормовые привкусы, выраженный кисломолочный вкус, горечь, крупитчатость. Не допускают к приемке творог плесневелый и загрязненный.

Сметану 30%-ой жирности по качеству делят на высший и 1-й сорта. Цвет белый с кремовым оттенком. Вкус и запах чистый, молочнокислый, с выраженными вкусом и ароматом, свойственными пастеризованным продуктам.

Консистенция однородная, в меру густая, без крупинок жира и белка, глянцевитая. Кислотность сметаны 65-900 о Т. В 1-м сорте допускается слабо выраженный кормовой вкус, наличие горечи, консистенция недостаточно густая, слегка комковатая, наличие легкой тягучести; кислотность 65-110 0 Т.

Остальные виды сметаны на сорта не подразделяют. Пороками сметаны являются жидкая, комковатая консистенция, прогорклый вкус и др. Не допускают к приемке сметану с горьким, кислым, кормовым вкусом и запахом, тягучую, загрязненную и с выделившейся сывороткой.

Лабораторные методы исследования исследования:

источник

Реакция Хеддльсона (пластинчатый метод)

Преимущество этого метода заключается в простоте постановки реакции, быстром получении результатов и чувствительности реакции. В качестве антигена для постановки реакции Хеддлсона и Райта применяют единый бруцеллезный диагностикум. Реакцию ставят на обычном оконном, тщательно вымытом, обезжиренном стекле, расчерченном на квадраты величиной 4 x 4 см каждый, по горизонтали должно быть 5 квадратов. На первом квадрате с левой стороны записывается номер испытуемой сыворотки, в последующие квадраты слева направо разливают (микропипеткой или 1 мл градуированной пипеткой) испытуемую сыворотку в следующих дозах: 0,04, 0,02, 0,01 и 0,03 (контроль сыворотки). К первым трем дозам сыворотки добавляют по 0,03 мл антигена. К последней дозе сыворотки (0,03) добавляют 0,03 мл физиологического раствора. Сыворотку осторожно смешивают с антигеном палочкой, начиная с минимальной дозы сыворотки. Контроль антигена ставят, добавляя 0,03 мл физиологического раствора к 0,03 мл антигена. Затем стекло слегка подогревают над пламенем спиртовки так, чтобы происходило равномерное нагревание всей поверхности стекла.

В случае положительной реакции в первые же минуты в каплях сыворотки с антигеном появляются хлопья (агглютинат). Максимальный срок наблюдения 8 минут. Контроль сыворотки ставят с каждой испытуемой сывороткой для исключения спонтанной агглютинации; контроль антигена ставят один (при любом числе испытуемых сывороток) для исключения спонтанной агглютинации применяемого антигена. Учет реакции проводят невооруженным глазом по следующей схеме: а) полное просветление жидкости с крупными и мелкими хлопьями, т.е. 100 % агглютинации (4+); б) почти полное просветление жидкости с ясно заметными хлопьями, т.е. 75 % агглютинации (3+); в) незначительное просветление жидкости с заметными хлопьями, т.е. 50 % агглютинации (2+); г) мутная жидкость с едва заметной зернистостью (+); д) равномерная мутная жидкость (-).

Для оценки результатов рекомендуется следующая схема: а) агглютинация на 4+ во всех дозах сыворотки — результат «резко положительный»; б) агглютинация не менее 2+ во всех дозах сыворотки — результат «положительный»; в) агглютинация только в первой или в первой и второй дозах сыворотки — результат «сомнительный»; г) отсутствие агглютинации во всех дозах сыворотки — реакция «отрицательная».

Для диагностики бруцеллеза имеет значение только положительный результат реакции. При сомнительном или отрицательном результатах реакции и наличии эпидемических и эпизоотических показаний, а также в стационаре и при обследовании доноров, где необходимо определение титра агглютининов и их динамики, следует применять реакции Райта и Кумбса, РПГА и ИФА.

Роз-Бенгал проба (РБП)

Роз-Бенгал проба, по сравнению с другими методами серологической диаг­ностики бруцеллеза, обладает следующими преимуществами: большой чувстви­тельностью, способностью в короткие сроки после заражения выявлять специ­фические бруцеллезные антитела и, благодаря кислой реакции антигена, ингибировать проявления неспецифических антител, а также стабильностью показаний, технической простотой постановки, требующей небольшой затраты труда и времени, четкостью и быстротой получаемых результатов.

Сыворотки крови, подлежащие исследованию, должны быть прозрачные, без примеси эритроцитов. Их исследуют не позднее, чем через 4 дня хранения при температуре плюс 4-8 °С.

Допускается исследовать сыворотки, консервированные сухой борной кис­лотой (2 % борной кислоты к объему сыворотки). Консервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 14 дней.

Антиген представляет собой суспензию инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл в буферном растворе, окрашенных бенгальским розовым в розовый цвет. Расфасован во флаконы из темного стекла, подлежит хранению в темном сухом месте при температуре плюс 4-12 °С. Срок годности антигена при соблюдении условий хранения 18 месяцев со дня его изготовления.

Антиген во флаконах без этикетки (надписи) или с трещинами, содержащий постороннюю примесь, неразвивающиеся хлопья, плесень, с истекшим сроком годности или подвергавшиеся замораживанию, для применения не годен.

Перед употреблением антиген выдерживают 30-40 мин. при комнатной температуре и затем тщательно встряхивают.

Техника постановки Роз-Бенгал пробы: реакцию проводят на чистых сухих металлических эмалированных пластинках или изразцовых плитках с лунками при комнатной температуре (плюс 18-30 °С).

Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки шприцем-полуавтоматом или микропипеткой, которые трижды промывают фенолизированным (карболизированным) физиологическим раствором и подсушивают фильтро­вальной бумагой.

В каждую лунку рядом с сывороткой пипеткой-капельницей вносят равное количество (0,03 мл антигена) и тщательно смешивают активным движением ручного полисмесителя на 5 или 25 проб для получения однородной смеси, рас­пределяя ее при этом по всей поверхности лунки.

Пластину с внесенными на нее сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин осторожными вращательными движениями вручную или при помощи автоматического прибора, предназначенного для этой цели. При положительной реакции появляются хлопья агглютината розового цвета.

В начале работы ставят контроль антигена с нормальной (отрицательной) и положительной агглютинирующей сыворотками в тех же дозах, а также контроль антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 мл антигена добавляют 0,03 мл физиологического раствора).

Учет реакции проводят невооруженным глазом в течение 4 мин. после смеши­вания сыворотки с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.

Агглютинацию, которая наступает позже, чем через 4 мин — не учитывают.

Реакцию считают положительной при наличии выраженной агглютинации в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета.

При отсутствии агглютинации (смесь гомогенна, равномерно окрашена) реакцию считают отрицательной.

После учета реакции пластинки дезинфицируют погружением на 5 мин в 3 % раствор фенола или 1 %-ный раствор хлорамина, затем тщательно промывают водопроводной водой, высушивают и используют повторно. Для этих целей можно применять кассеты и штативы сушилки.

При нечетко выраженной агглютинации проводят повторное исследование.

По результатам повторного исследования дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).

Сыворотки, с которыми получена положительная РБП, исследуют в РА и РСК (РДСК) для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих антител. Сыворотки, с которыми получена отрицательная РБП, дополнительно в РА и РСК (РДСК) не исследуют.

Кольцевая реакция с молоком

Кольцевая реакция применяется с целью ориентировочной проверки благо­получных по бруцеллезу молочных стад и для проверки молока на рынках.

Сущность кольцевой реакции заключается в том, что в молоке бруцеллезных животных при добавлении антигена образуется комплекс антитела с антигеном, который адсорбируется жировыми частицами молока. Жировые частицы вслед­ствие своего малого удельного веса поднимаются наверх, увлекая адсорбиро­ванный агглютинат, который в зависимости от цвета антигена образует на по­верхности жидкости окрашенное кольцо.

Для кольцевой реакции применяют цветной антиген Триленко, представ­ляющий взвесь убитых, окрашенных бруцеллезных микробов.

Для исследования необходимо брать цельное, лучше свежее, молоко или консервированное формалином (из расчета 0,1 мл 10 % раствора формалина на 10 мл молока).

В пробирку берут 2 мл молока и добавляют 0,1 мл (2 капли) концентрирован­ного антигена, тщательно встряхивают и помещают в водяную баню или термостат на 45-50 мин при температуре 37-39 °С.

Учет реакции: а) если в верхней части столбика молока (в слое сливок) четко выражено синее кольцо, а остальная часть молока белая, реакция оценивается положительной — 100 или 75 % агглютинации (+ + + + и + + +); б) при наличии достаточно выраженного синего кольца в слое сливок, а ос­тальная часть молока синеватого цвета, реакция оценивается положительной – 50 % агглютинации (+ +); в) если синее кольцо в слое сливок слабо выражено и весь столбик молока имеет синий цвет, реакция считается сомнительной — 25 % агглютинации (+ и ±); г) если столбик молока равномерно окрашен в синий цвет, а слой сливок ос­тается белым или слегка желтоватым, реакция отрицательная (-).

Молоко от коров с сомнительной реакцией исследуют повторно через 10-15 суток. При получении отрицательного или снова сомнительного результата животных считают благополучными по бруцеллезу.

Пластинчатая реакция агглютинации (исследование молока)

Данная реакция применяется для исследования только свежего молока и молочной сыворотки. Не подлежит исследованию пастеризованное, кипяченое и замороженное молоко (в таком молоке антибруцеллезные агглютинины раз­рушаются), а также молоко, имеющее кислотность выше 30 °С по Тернеру (во избежание получения неспецифических результатов).

Реакцией агглютинации можно исследовать молоко жирное (цельное), обез­жиренное (снятое) и молозиво. Жирное молоко предварительно обезжиривают отстаиванием или центри­фугированием, затем из-под слоя сливок забирают молоко для исследования. Обезжиренное молоко и молозиво исследуют без предварительной подго­товки, но так, чтобы сливок попало минимальное количество.

Обезжиренное молоко наносят на стекло (чашку Петри) в коли­честве 0,1 мл (или двух капель) и 0,05 мл (или одной капли). К каждой дозе испытуемого молока добавляют по одной капле бруцеллезного диагностикума. Реакция сопровождается двумя контролями: к 0,05 мл диагностикума добавляют 0,1 мл физиологического раствора и 0,1 мл испытуемого молока смешивают с 0,05 мл 12 % раствора хлористого натрия. Путем покачивания стекла смеши­вают ингредиенты. Учет реакции производят в первые 3-5 мин.

Положительная реакция агглютинации характеризуется выпадением хлопьев с большим или меньшим обесцвечиванием молока. При отрицательном резуль­тате молоко остается равномерно окрашенным в голубой цвет (цвет антигена).

Исследование молочной сыворотки

Перед получением молочной сыворотки жирное молоко обезжиривают путем центрифугирования или отстаивания. Молочную сыворотку получают при ство­раживании молока сычужным ферментом. Для этого к 5 мл молока добавляют 1-2 капли 10 % сычужного фермента на физиологическом растворе хлористого натрия. Пробирки помещают при температуре 37 °С на 20-30 мин (до свертывания молока). Молочную сыворотку можно получить также путем помещения молока при 37 °С на сутки. Молочную сыворотку сразу отделяют путем фильтрования через бумажный фильтр. Дальнейшие манипуляции: постановка реакции и учет результатов анало­гично постановке и учету реакции агглютинации с цельным молоком.

При оценке результатов исследования молока на бруцеллез при помощи пластинчатой реакции агглютинации необходимо учесть возможность образования мелкохлопчатого агглютината, который из-за мутности молока может быть не отмечен и результаты реакции могут быть приняты за отрицательные. В отри­цательных реакциях рекомендуется молоко исследовать в реакции агглютинации с молочной сывороткой.

Последнее изменение этой страницы: 2016-12-30; Нарушение авторского права страницы

источник

При заболевании коров бруцеллезом в молоке появляются антитела, которые при добавлении к молоку бруцеллезного антигена склеиваются (реакция агглютинации) и адсорбируются на жировых шариках.

Ход определения в пробирку диаметром 5-8мм наливают 1мл молока и 1 каплю цветного бруцеллезного антигена (взвесь бруцелл, окрашенных гематоксилином) и ставят в термостат при температуре 37°С на 40-45мин. Положительная реакция характеризуется появлением в верхнем слое жидкости кольца синего цвета, при сомнительной реакции -слабоокрашенного синеватого кольца, а при отрицательной — никаких изменений не наступает.

5. УИРС. Ветеринарно-санитарная оценка исследуемых проб молока с заполнением качественного удостоверения.

Контрольные вопросы

1. Отбор проб молока. Пороки молока.

2. Методы исследования молока.

3. Ветеринарно-санитарная оценка молока, полученного от животных, больных инфекционными болезнями (туберкулез, бруцеллез, лейкоз, ящур и др.).

4. Ветеринарно-санитарная экспертиза молока коров при незаразных болезнях и субклинических маститах.

УДОСТОВЕРЕНИЕ О КАЧЕСТВЕ №

Выдано на молоко____________________________________________________ ,

предприятие-изготовитель, район, город

Наименование показателя Результаты исследования
1. Органолептическое исследование:
-запах
-цвет
-консистенция
-вкус
2. Лабораторные исследования
-опр. чистоты
-опр. кислотности
-опр. плотности
-опр. бактериальной обсемененности
-контроль пастеризации
-установление молока коров, больных маститом
3. контроль натуральности молока:
-опр. добавления воды
-опр. подснятия жира
-опр. двойной фальсификации
-реакция на формалин
-реакция на перекись водорода
-реакция на соду
-реакция на кровь и гной
-реакция на кетоновые тела
-реакция на антибиотики
-кольцевая проба на бруцеллез
Заключение:

Показатели безопасности подтверждены сертификатом

Дата выработки «_____» ___________г.

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ НАДЗОР ___________________________________ Субъект Российской Федерации ___________________________________ Район (город) ___________________________________ Наименование учреждение ФОРМА №2 Выдается ветеринарными врачами на животных (включая птиц, рыб, насекомых), а также биологические объекты, используемые для их размножения

ВЕТЕРИНАРНОЕ СВИДЕТЕЛЬСТВО № 00 – 000000

от«_____»_______________________________200 г

Я, нижеподписавшийся ветеринарный врач, выдал настоящее ветеринарное свидетельство

(кому — наименование юридического лица или ФИО физического лица)

в том, что_______________________________________________________________

( наименование продукта или сырья животного происхождения согласно ГОСТ, ОСТ, ТУ)

в количестве ___________ ____________ _____________

(мест, штук, кг) (упаковка) (маркировка)

(наименование предприятия. Ф.И.О. владельца, адрес), (дата выработки) подвергнута ветеринарно-санитарной экспертизе в полном объеме изготовлена из сырья, прошедшего ветеринарно-санитарную экспертизу (ненужное зачеркнуть), и признана годной для

(реализации без ограничений, с ограничением — указать причины

или переработки согласно правилам ветсанэкспертизы)

(вид транспорта, маршрут следования)

(наименование и адрес (№ товаротранспортных документов)

Продукция подвергнута дополнительным лабораторным исследованиям

(наименование лаборатории, № экспертизы и результаты исследования)

_________________________________________________________________ (указываются эпизоотическое благополучие местности, дата и номер разрешений вышестоящего)

_____________________госветинспектора на вывоз продукции за пределы территории, перечисляются №№ клейм и др )

Свидетельство предъявляется для контроля при погрузке в пути следования и передается грузополучателю Копии свидетельства недействительны. При установлении нарушений порядка заполнения бланка свидетельство передается главному госветинспектору Субъекта российской Федерации по месту выхода груза с указанием выявленных нарушений

М.П. ФИО ветеринарного врача (полностью)

Пороки цвета молока.

Синий и голубой Развитие в молоке пигментообразующих бактерий (Васt. ciапоgепеs, Bасt. сiапоf1иоrеsсепs), некоторых дрожжевых и плесневых грибов, поедание гречихи, люцерны, вшей, незабудки, донника, маститы, туберкулез вымени, разбавление молока водой, подснятие жира, хранение молока в оцинкованной посуде.
Излишне жёлтый Наличие микроорганизмов, дрожжей и грибов, вырабатывающих желтый пигмент (Рзеиdотопаs fluorescens, Р. риltida, Sarcina lutea. Sacina flava. Microfacer flavum), гнойное воспаление (стрептококковое) вымени, туберкулез вымени (поражение паренхимы), примесь молозива, поедание некоторых кормов (зеленая масса, кукуруза, морковь, шафран, зубровка), лекарственные препараты (тетрациклин, акридиновые краски), сибирская язва, лептоспироз, ящур, молоко коров жирномолочных пород (джерсейская, гернсейская)
Кровянистый Наличие дрожжей и микроорганизмов, вырабатывающих красный пигмент (Sarcina rubra. Micrococcus roseus) нарушение правил машинного доения, механическое повреждение вымени, скармливание растений (лютиковых, молочайных и хвощей), молодых побегов лиственных и хвойных деревьев, осоки, сибирская язва, туберкулез, мастит, отравления.

Дата добавления: 2016-10-06 ; просмотров: 2100 | Нарушение авторских прав

источник

Сущность кольцевой реакции.

По наблюдениям некоторых ученых данная реакция пригодна для исследования фляжного молока, если оно содержит молоко хотя бы одной бруцеллезной коровы.

Молоко повышенной кислотности (32-33ºТ), молозиво, молоко коров, больных маститом, и содержимое молочной железы сухостойных коров не дают правильных показателей по этой реакции. Пробы молока, консервированные формалином, разведенные пополам водой, и свежие сливки после их разведения 10% раствором хлорида натрия 1:1 можно исследовать по кольцевой реакции.

Реакция заключается в том, что добавленный в молоко бруцеллезный антиген соединяется (склеивается) с антителом. Возникший комплекс антитело+антиген адсорбируется на жировых шариках, которые при температуре реакции поднимаются на поверхность содержимого пробирки, образуя кольцо синего цвета. При отсутствии антител антиген распределяется равномерно в молоке и синее кольцо не образуется.

Техника определения.

В агглютинационные пробирки наливают 1мл исследуемого молока и добавляют 1каплю цветного бруцеллезного антигена (смыв культуры бруцелл, окрашенных гематоксилином). Для равномерного распределения антигена в молоке содержимое встряхивают и пробирки ставят в термостат при 37-39ºС на час, после чего читают реакцию.

При исследовании молока овец кольцевой реакцией рекомендуется разводить молоко 10-20% раствором хлорида натрия или молоком коровы (здоровой) 1:1.

«+» реакция – характеризуется тем, что в верхнем слое пробирки появляется кольцо, окрашенное в интенсивно синий цвет при некотором просветлении содержимого пробирки;

«-»реакция – равномерное окрашивание содержимого; слой сливок остается белого или коричневого цвета.

«±» реакция – наличие слабого окрашивания кольца без просветления содержимого пробирки.

Техника определения.

К 10мл теплого молока (35-37ºС) + 5капель 10% сычужного фермента (на физ.растворе) и помещают на 5мин в водяную баню при температуре 38-40ºС для быстрого свертывания. Свернувшееся молоко обводят стеклянной палочкой по стенке пробирки, центрифугируют и полученную прозрачную надосадочную жидкость (сыворотку) используют для исследования. Для реакции берут по 1мл сыворотки в 6 разведениях (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 и 1:160), добавляют в каждую пробирку по 0.5 мл стандартного антигена, затем пробирки встряхивают и помещают на 30мин в термостат при 37ºС. После выдержки в термостате пробы центрифугируют 5мин при 3000об/мин и читают реакцию.

«+» реакция – в пробирке появляется осадок в виде круглой шляпки, которая при взбалтывании разбивается на хлопья и комочки.

«-» реакция – осадок при взбалтывании образует равномерную муть.

Для осаждения казеина вместо сычужного фермента можно применять уксусную кислоту.

Способы установления молока коров, больных маститом.

Методические указания.

Для диагностики субклинических маститов используют основные пробы с димастином или мастопримом. Если эти реакции положительные, их уточняют пробой «отстаивания». При заболевании у коров вымени в молоке увеличивается число лейкоцитов и проявляется щелочная реакция (рН 7 и выше), что устанавливают с помощью димастина и мастоприма, содержащих поверхностноактивные вещества, которые, взаимодействуя с лейкоцитами, образуют сгусток, а индикатор изменяет цвет в зависимости от реакции среды (рН).

А. Бромтимоловая проба.

Техника определения.

На белую фарфоровую пластинку наносят 2-4капли исследуемого молока и 1-2капли 0.2% спиртового (спирт 60%) раствора бромтимолового синего.

Желтое, зеленовато-желтое или желто-зеленое окрашивание характерно для молока, полученного от здоровой коровы. Молоко коров, больных маститом, в зависимости от стадии заболевания и его характера окрашивается в цвета от сине-зеленого до желтоватого.

Б. Лейкоцитарная проба.

Техника определения.

На молочно-контрольную пластинку наносят 5капель молока и 1каплю 4% едкого натра, перемешивают палочкой в течение 20с и определяют результат пробы. При воспалительном процессе в молочной железе (мастит) на пластинке появляется желеобразная масса (значительное количество лейкоцитов), а при нормальном количестве лейкоцитов изменения не наблюдаются – проба отрицательная.

Реакция заключается в том, что под влиянием щелочи лейкоциты растворяются с освобождением ДНК (вещество ядра), обуславливающей желеобразование в пробе.

В.Проба отстаиванием.

Техника определения.

В пробирку наливают по 10-15мл исследуемого молока и отстаивают его при температуре 4-8ºС. Пробирки просматривают вначале через 2-3ч и окончательно через 16-24ч.

В молоке с наличием мастита на дне пробирки появляется осадок белков молока, клеток и микробов, в котором при микроскопировании обнаруживается значительное количество лейкоцитов. Такое молоко часто бывает водянистым, с синеватым оттенком (субклиническая форма). Появление розового цвета в слое сливок будет свидетельствовать о наличии эритроцитов.

Г. Проба с димастином.

Техника определения

В луночки молочно-контрольной пластинки помещают по 1мл исследуемого молока, затем вносят по 1мл димастина. Перемешивают реактив и молоко вращательными движениями и в каждой луночке определяют консистенцию и цвет смеси.

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.

Папиллярные узоры пальцев рук — маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.

источник

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА

Animals. Laboratory diagnostics of brucellosis. Serological methods

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2017 г. N 99-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

Госстандарт Республики Казахстан

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 июня 2017 г. N 582-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34105-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2018 г.

5 ВЗАМЕН ГОСТ 25385-91 в части серологических методов диагностики

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы серологической диагностики бруцеллеза:

— реакция агглютинации с S — и R -бруцеллезными антигенами;

Читайте также:  Актриса умершая от бруцеллеза

— пластинчатая реакция агглютинации с антигеном, окрашенным бенгальской розовой (роз бенгал проба);

— реакция связывания комплемента;

— реакция длительного связывания комплемента на холоде;

— реакция непрямой гемагглютинации;

— реакция иммунодиффузии в геле агара с олигополисахаридным антигеном;

— реакция иммунодиффузии в геле агара с R -бруцеллезным антигеном;

— кольцевая реакция с молоком;

— иммуноферментный анализ;

— иммунохроматографический анализ.

Примечание — Методы применимы ко всем видам бактерий рода Brucella.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.0.004-2015 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация

ГОСТ 1625-2016 Формалин технический. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2651-78 Натрия бихромат технический. Технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4220-75 Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ ISO 7218-2015 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16445-2012 Сыворотка гемолитическая для реакции связывания комплемента. Технические условия

ГОСТ 16446-2012 Комплемент сухой для реакции связывания комплемента. Технические условия

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 18704-78 Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия

ГОСТ 25134-2013 Бруцеллин ВИЭВ. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования

ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

ГОСТ 33675-2015 Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Бактериологические методы

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3.1 В настоящем стандарте применены термины с соответствующими определениями по ГОСТ 33675.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

— РА — реакция агглютинации;

— РСК — реакция связывания комплемента;

— РБП — пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном;

— РДСК — реакция длительного связывания комплемента;

— РИД — реакция иммунодиффузии;

— ЛПС — липополисахаридный антиген;

— О-ПС — олигополисахаридный антиген;

— РНГА — реакция непрямой гемагглютинации;

— КР с молоком — кольцевая реакция с молоком;

— ИФА — иммуноферментный анализ;

— ИХА — иммунохроматографический анализ;

— PKг-G — раствор конъюгата, конъюгированного с пероксидазой;

— ФСБ-Т — фосфатно-солевой буферный раствор с твином;

— РБР-С — разводящий буферный раствор для сывороток;

— ТМБ-субстрат — тетраметилбензидин-субстрат;

— К+ — инактивированная сыворотка крови животных, содержащая специфические антитела класса G к бактериям рода Brucella (положительный контрольный образец);

— К- — инактивированная сыворотка крови животных, не содержащая специфических антител к бактериям рода Brucella (отрицательный контрольный образец).

4.1 Условия выполнения исследований

4.1.1 Общие требования к помещениям — по ГОСТ ISO 7218.

4.1.3 К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами II группы патогенности*, изучившие методики микробиологических работ. В зонах неблагополучных по бруцеллезу сотрудники должны быть вакцинированы против бруцеллеза.
________________
* Группу патогенности устанавливают в соответствии с нормативными правовыми актами, действующими на территории государства, принявшего стандарт.

4.2 Требования безопасности

4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ с микроорганизмами — согласно ГОСТ 12.1.008.

4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.4.011.

4.2.3 Воздух рабочей зоны должен соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.005.

4.2.4 Обучение персонала безопасности труда — в соответствии с ГОСТ 12.0.004.

4.2.5 Обеззараживание материала после исследований, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 1 ч при давлении 2 атм (0,2) МПа и температуре (132±2)°С.

При проведении исследований используют следующие средства измерений, оборудование, материалы, реактивы и животных:

— pH-метр с точностью калибровки ±0,1 ед.pH при температуре от 20°С до 55°С;

— спектрофотометр с диапазоном длины волны от 198 до 1000 нм, разрешением 1 нм и точностью ±2 нм;

— пипетки градуированные выдувные вместимостью от 1 до 10 см по ГОСТ 29230;

— колбы мерные по ГОСТ 1770 исполнения 2 различной вместимости 1-го класса точности;

— центрифуга лабораторная со скоростью вращения ротора 2000-3000 об/мин;

— автоклав лабораторный;

— термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20°С до 50°С;

— баня водяная с терморегулятором с температурой нагрева до 100°С;

— холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от 0°С до 10°С по ГОСТ 16317;

— насос вакуумный;

— иглы препаровальные;

— штамп для формирования лунок в агаре;

— осветитель настольный с пределом поворота фонаря вокруг горизонтальной и вертикальной осей 0-360 и источником света — лампой В/Ватт-8/20;

— чашки биологические (Петри) с крышками ЧБН 2 по ГОСТ 25336;

— чашка и ступка фарфоровые по ГОСТ 9147;

— комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез, в который входят:

1) шприц-полуавтомат (капельница) для дозирования сыворотки;

2) пипетка-капельница для дозирования антигена;

3) ручной смеситель на 25 лунок диагностической пластины;

4) аппарат для автоматического покачивания диагностических пластин;

— пластины с лунками 72-гнездные полистироловые (планшеты);

— штативы 100-гнездные для пробирок Флоринского;

— групповые дозаторы Флоринского;

— пробирки серологические Флоринского;

— микропипетки вместимостью от 0,1 до 0,5 см ;

— дозаторы одноканальные пипеточные переменного объема;

— наконечники для дозаторов вместимостью 0,2; 0,5; 1,0 см ;

— фильтры бумажные из бумаги фильтровальной по ГОСТ 12026;

— бумага фильтровальная по ГОСТ 12026;

— салфетки марлевые;

— спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962;

— вода дистиллированная по ГОСТ 6709;

— кислота соляная по ГОСТ 3118 х.ч;

— фенол по ГОСТ 23519 — 5%-ный раствор;

— формалин по ГОСТ 1625 — 1%-ный и 10%-ный растворы;

— натрий хлористый по ГОСТ 4233;

— кислота борная по ГОСТ 18704 — 3%-ный раствор;

— натрия бихромат по ГОСТ 2651;

— калий двухромовокислый по ГОСТ 4220;

— кислота серная по ГОСТ 4204;

— натрия гидроокись по ГОСТ 4328;

— сыворотка гемолитическая по ГОСТ 16445;

— комплемент сухой для РСК по ГОСТ 16446;

— кровь барана-донора;

— свинки морские массой 300-400 г;

— сыворотки крови животных;

— набор для ИФА, содержащий в своем составе:

1) планшет полистироловый 96-луночный с адсорбированной в лунках планшета смесью специфических антигенов Brucella ;

7) флакон N 6 — ТМБ-субстрат;

8) флакон N 7 — стоп-реагент объемом 6 см ;

— тест-система для определения антител к ЛПС антигену В.abortus и В. melitensis в сыворотке крови крупного рогатого скота и овец методом ИФА, содержащая в своем составе компоненты:

1) К — иммунохроматографические тест-полоски, нитроцеллюлозные мембраны на полимерной основе белого цвета, ламинированные защитными этикетками с обозначениями разного цвета: в нижней части — стрелки, указывающие направления погружения полоски в тестируемую пробу; в верхней части — название рода и вида возбудителя исключаемой болезни;

2) К — буферный раствор для разведения проб объемом 0,8 см ;

— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных);

— антиген бруцеллезный для РА и РСК (РДСК);

— роз бенгал антиген для РБП;

— антиген бруцеллезный для КР с молоком;

— 0,85%-ный раствор хлористого натрия;

— 0,85%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;

— 5%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;

— 10%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;

— раствор хлорамина 5%-ный;

— взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов;

— молоко от здоровой коровы (буйволицы);

— набор для РИД, содержащий в своем составе:

1) О-ПС бруцеллезный антиген;

3) микробиологический агар-агар по ГОСТ 17206;

— набор для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота, содержащий в своем составе:

1) антиген бруцеллезный эритроцитарный для РНГА;

2) взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов;

4) сыворотку негативную.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов, дезинфицирующих средств и материалов по качеству не ниже указанных. Допускается использование посуды одноразового применения.

6.1.1 Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при 30°С-38°С в течение 1 ч или при комнатной температуре в течение 8-10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4°С-10°С. Через 20-24 ч после взятия крови отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию в свежем или консервированном виде (сыворотку крови собак сливают через 3-4 ч и повторно через 10-12 ч).

6.1.2 Консервирование сывороток проводят:

— добавлением 0,05 см (1 капля) 5%-ного раствора фенола на 1 см сыворотки при тщательном перемешивании;

— сухой борной кислотой (3-4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;

— путем однократного замораживания.

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при температуре от 2°С до 8°С.

Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут, замороженные сыворотки — в течение 3 сут после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки к исследованию на бруцеллез не пригодны.

6.2 Для исследования молока на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут из каждой доли вымени одного удоя в одну бактериологическую пробирку в количестве 10-15 см . При этом если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и др.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

6.2.1 Молоко исследуют свежее или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10%-ного раствора формалина на 5 см молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2-3 сут. Перед исследованием молоко тщательно перемешивают для равномерного распределения сливок.

6.2.2 При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.

6.2.3 Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.

6.3 На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ.

7.1 Сущность методов заключается в выявлении в сыворотке крови животных специфических антител к бруцеллезным антигенам.

7.2 Пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном (РБП)

7.2.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в выявлении специфических антител в сыворотке крови животных, основанном на способности антител сыворотки агглютинировать бруцеллезный антиген, результатом чего является формирование выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена в виде крупных или мелких хлопьев розового цвета.

7.2.2 Подготовка к исследованию

7.2.2.1 Приготовление 5%-ного раствора хлорамина

Для приготовления 5%-ного раствора хлорамина 5 г хлорамина растворяют в 100 см водопроводной воды. Раствор используют свежеприготовленным.

Примечание — Могут применяться другие растворы дезинфицирующих средств, эффективные в отношении бактерий рода Brucella, которые готовят в соответствии с инструкциями к ним.

7.2.2.2 Для массовых диагностических исследований используют комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез в соответствии с разделом 5.

Перед постановкой реакции роз бенгал антиген и исследуемые сыворотки выдерживают 30-40 мин при комнатной температуре и встряхивают для получения однородной смеси.

Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных диагностических пластинах с лунками при температуре не ниже 18°С. На бортиках пластинки против каждой лунки записывают номер исследуемой сыворотки.

7.2.3 Проведение исследования

7.2.3.2 После внесения каждой сыворотки шприц-полуавтомат (микропипетку) трижды промывают фенолизированным 0,85%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2 и кончик подсушивают фильтровальной бумагой. При исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов в каждую лунку рядом с сывороткой при помощи пипетки-капельницы для антигена, или микропипетки, или одноканального дозатора с наконечником вносят 0,03 см антигена (две капли), а при исследовании сывороток крови овец, коз и северных оленей (маралов), свиней и собак — 0,015 см антигена (одну каплю). Затем антиген в каждой лунке тщательно смешивают с сывороткой активными движениями ручного смесителя до получения однородной жидкости, распределяя ее при этом по всей поверхности лунки. После смешивания сывороток во всех лунках пластинки смеситель ополаскивают 0,85%-ным фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2 и просушивают марлевой салфеткой или фильтровальной бумагой.

Пластинку с сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин осторожными вращательными движениями вручную или при помощи аппарата, предназначенного для этой цели. При положительной реакции в течение 4 мин появляются мелкие или крупные хлопья агглютината розового цвета.

В начале работы ставят контроль антигена с негативной и бруцеллезной сыворотками в тех же дозах, а также антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 см 0,85%-ного фенолизированного раствора хлористого натрия добавляют 0,03 см роз бенгал антигена).

По окончании работы диагностические пластинки дезинфицируют погружением на 5 мин в 5%-ный раствор хлорамина либо другого дезинфицирующего средства в концентрации и экспозиции, определенной для возбудителя данного вида, затем обрабатывают любым моющим средством, промывают водопроводной, затем дистиллированной водой, высушивают на воздухе или в термостате при температуре 37°С-38°С и используют повторно.

7.2.4 Обработка результатов

Учет результатов реакции проводят визуально в течение 4 мин после смешивания сывороток с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.

Реакцию считают положительной при наличии агглютината в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета.

Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенная и равномерно окрашенная).

При не четко выраженной агглютинации проводят повторное исследование сыворотки и по его результатам дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).

При получении отрицательных результатов РБП по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.

Сыворотки крови животных стада (фермы, населенного пункта), положительно реагирующие в РБП, исследуют на бруцеллез в РА и РСК (РДСК), или в РА и РИД, или в РНГА, или в ИФА, или в ИХА.

7.3 Кольцевая реакция (КР) с молоком

Сущность метода состоит в выявлении антигеном специфических антител в молоке больных бруцеллезом или иммунизированных агглютиногенными противобруцеллезными вакцинами коров. Положительная реакция проявляется в образовании синего кольца в верхнем слое сливок.

КР с молоком применяют с целью определения благополучия стад (ферм) по бруцеллезу крупного рогатого скота (буйволов) и для проверки молока при продаже его на рынках.

Исследование молока на бруцеллез в КР можно проводить в лабораториях или непосредственно в хозяйствах.

7.3.1 Подготовка к исследованию

Для постановки КР с молоком применяют тест-системы или наборы для диагностики бруцеллеза в кольцевой реакции (КР), используемые на территории государств, принявших стандарт, в состав которых входят антиген бруцеллезный для КР с молоком и сыворотка бруцеллезная. Реакцию ставят в серологических пробирках Флоринского, которые нумеруют в соответствии с описью проб молока, пробы которого отбирают по 6.1.

7.3.2 Проведение исследования

В пробирки вносят по 2 см молока пипеткой или дозатором. После каждой пробы пипетку двукратно промывают теплой водопроводной водой. Антиген вносят по 0,1 см в каждую пробирку с пробой молока. После внесения антигена в пробирки одного ряда штатив энергично встряхивают и т.д. После внесения антигена во все пробирки штатив встряхивают дополнительно.

При исследовании каждой партии молока ставят контрольные пробы:

— молоко от заведомо здоровой коровы (буйволицы);

— смесь молока здоровой коровы (буйволицы) с бруцеллезной сывороткой (0,1 см сыворотки на 2 см молока).

Штативы с исследуемыми контрольными пробами молока выдерживают на водяной бане при температуре 37°С-38°С в течение 1 ч или в термостате в течение 2 ч.

Результаты реакции учитывают визуально через 30-40 мин после извлечения штативов из водяной бани (термостата) и оценивают в крестах по следующей схеме:

«+++» (три креста) — четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока остается белой;

«++» (два креста) — четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока имеет синеватый цвет;

«+» (один крест) — синее кольцо в слое сливок выражено слабо, и весь столбик молока имеет синий цвет;

«-» (минус) — столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий цвет, который был получен сразу после смешивания с антигеном, а слой сливок — белого или слегка желтоватого цвета.

7.3.3 Обработка результатов

Все пробы молока с оценкой в «+++» (три креста) и «++» (два креста) считают положительными, «+» (один крест) — сомнительными.

При получении отрицательных результатов КР по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.

Сыворотку крови животных стада (группы, населенного пункта), в котором выявлены особи, сомнительно или положительно реагирующие в КР, исследуют на бруцеллез в РБП, или в РА и РСК (РДСК), или в РА и РИД, или в РНГА, или в ИФА. При этом проводят клинический осмотр животных и исключают их заболевание маститами.

7.4 Реакция агглютинации (РА) в пробирках

7.4.1 РА в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, лошадей, верблюдов, оленей (маралов), собак, пушных зверей и морских свинок.

7.4.2 Приготовление фенолизированных растворов хлористого натрия с содержанием фенола 0,5%

В 1 дм дистиллированной воды растворяют соответственно 8,5, 50 и 100 г хлористого натрия и добавляют к каждому раствору по 5 г фенола. Растворы фильтруют дважды через бумажный фильтр. Растворы хранят в стеклянных бутылях, укупоренных резиновыми пробками при температуре от 2°С до 20°С, и используют в течение 1 мес.

7.4.3 Проведение исследования

7.4.3.1 При исследовании в РА сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок и антиген разводят фенолизированным 0,85%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2; овец и коз — фенолизированным 5%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2; оленей (маралов) — фенолизированным 10%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2.

7.4.3.2 Сыворотки крови исследуют в четырех разведениях в пробирках Флоринского в объеме 1 см :

— для крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

— для овец, коз, оленей (маралов) и собак — в разведениях 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200;

— для собак с R -бруцеллезным антигеном ( B.canis ) — в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

— для пушных зверей и морских свинок — в разведениях 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

Исследование каждой сыворотки проводят в пяти пробирках.

7.4.3.3 Получение исходного разведения проб сыворотки:

— сыворотки крови крупного рогатого скота (лошадей, верблюдов) по 0,1 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2,4 см фенолизированного 0,85%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:25);

— сыворотки крови овец, коз и собак по 0,2 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2,3 см фенолизированного 5%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:12,5);

— сыворотку крови оленей и маралов по 0,2 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2,3 см фенолизированного 10%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:12,5);

— сыворотку крови пушных зверей и морских свинок по 0,3 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 1,2 см фенолизированного 0,85%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:5);

— при исследовании с R -бруцеллезным антигеном (B.canis) сыворотку крови собак по 0,1 см вносят в пробирки, содержащие по 2,4 см фенолизированного 0,85%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:25).

В пробирки второго ряда раствор хлористого натрия не вносят.

В пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0,5 см соответствующего фенолизированного раствора хлористого натрия по 7.4.2.

Затем в пробирки второго и третьего рядов вносят по 0,5 см исходного разведения сыворотки.

После пипетирования (не менее трех раз) разведение сыворотки из третьего ряда по 0,5 см переносят в пробирки четвертого ряда и после пипетирования из четвертого — в пятый. Из пробирок пятого ряда 0,5 см жидкости удаляют. Таким образом, получают последовательные двукратные разведения образцов сыворотки.

7.4.3.4 В пробирки второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0,5 см антигена в рабочем разведении 1:10 (1,0+9,0 см ) соответствующим фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2.

После внесения антигена разведение сыворотки в каждой пробирке удваивается.

В пробирки первого ряда антиген не вносят, они служат контролем сыворотки на самоагглютинацию. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.

После добавления к исследуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками интенсивно встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при температуре 37°С-38°С на 16-20 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.

7.4.3.5 На территориях, угрожаемых или неблагополучных по бруцеллезу, проводят массовые серологические исследования. При этом допускается проведение исследований в двух разведениях. Сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с резиновой грушей), или групповыми дозаторами Флоринского, или одноканальными пипеточными дозаторами в две серологические пробирки Флоринского в дозах 0,02 и 0,01 см (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 см при исследовании сывороток овец, коз, оленей (маралов) и собак. Затем в каждую пробирку вносят по 1,0 см антигена, разведенного соответствующим фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2 в соотношении 1:20. При этом сыворотки крови будут разведены соответственно 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При получении положительных или сомнительных результатов РА при массовом исследовании эти сыворотки исследуют в четырех разведениях.

Массовые исследования пушных зверей и морских свинок не проводят.

7.4.4 Обработка результатов

Результаты реакции учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки до и затем, после легкого встряхивания, оценивают в крестах по следующей схеме:

«++++» (четыре креста) — полное просветление жидкости, микробные клетки антигена осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

«+++» (три креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик» агглютината (75% агглютинации);

«++» (два креста) — неполное просветление жидкости, «зонтик» агглютината умеренно выражен (50% агглютинации);

«+» (один крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик» агглютината выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25% агглютинации);

«-» (минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» агглютината не наступило, на дне пробирки по центру образуется небольшой осадок микробов антигена в виде точки или пятна. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимается вверх в виде косички и равномерно распределяется в жидкости, которая при этом приобретает первоначальную мутность.

За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация на два креста («++»), что соответствует количеству международных единиц (ME) антител в 1 см сыворотки (например, сыворотка с титром 1:100 содержит 100 ME, 1:200 — 200 ME и т.д.).

Для более объективной оценки результатов РА готовят образцы сравнения мутности, соответствующие 75%, 50%, 25% и 0% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно вносят 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 см антигена, разведенного 0,85%-ным фенолизированным раствором хлористого натрия в соотношении 1:10. Затем в том же порядке в три первые пробирки добавляют 1,5; 1,0 и 0,5 см соответствующего фенолизированного раствора хлористого натрия по 7.4.2. После перемешивания содержимого пробирок из каждой из них переносят по 1,0 см в серологические пробирки. Полученные образцы сравнения мутности соответствуют 75%, 50% и 25% просветления жидкости. В четвертой пробирке просветление отсутствует. Образцы сравнения мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.

Читайте также:  Актриса которая болела бруцеллезом

При массовых исследованиях в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на два креста («++») в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.

В заключении лаборатории о результатах исследования должны быть отражены диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженный в международных единицах (например: титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:200 с оценкой два — четыре креста — «положительная» 200 МЕ/см ; титр сыворотки 1:100 с оценкой два — четыре креста — «сомнительная» 100 МЕ/см ).

Результаты исследования исследуемой и контрольных сывороток, серию антигена, срок его годности записывают в журнал серологических исследований.

7.5 Реакция связывания комплемента (РСК) и реакция длительного связывания комплемента на холоде (РДСК)

7.5.1 РСК применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов), собак и пушных зверей.

Сущность реакции состоит в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент, т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген — антитело.

7.5.2 РДСК применяют вместо РСК, в том числе для исследования сывороток, обладающих антикомплементарными свойствами.

Сущность реакции состоит в образовании иммунного комплекса антиген — антитело в присутствии комплемента на холоде в течение нескольких часов.

7.5.3 Подготовка к исследованию

7.5.3.1 Приготовление 0,85%-ного раствора хлористого натрия

Для приготовления 1 дм раствора 8,5 г хлористого натрия растворяют в дистиллированной воде, устанавливают pH 6,8-7,2 ед.pH 5%-ным раствором натрия гидроокиси и дважды фильтруют через бумажный фильтр. 0,85%-ный раствор хлористого натрия хранят в стеклянной бутыли, закрытой резиновой или корковой пробкой, и используют в течение 1 мес.

20 — исходное разведение комплемента (1:20).

Так как количество комплемента в рабочем разведении, требующемся для всей реакции (на 100 пробирок), равно 20 см (0,2·100), то к 0,6 см регидратированного комплемента добавляют 19,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.

Гемолитическую сыворотку титруют по ГОСТ 16445 при использовании каждой новой серии и по истечении срока годности.

Рабочий титр гемолитической сыворотки для РСК и РДСК составляет удвоенную дозу от титра. Так, если титр сыворотки равен 1:1500, то рабочий титр в РСК и РДСК будет 1:750.

Эритроциты барана — 2,5%-ную взвесь эритроцитов барана в 0,85%-ном растворе хлористого натрия для РСК и РДСК готовят из свежей или консервированной крови барана по ГОСТ 16446 . Дефибринированную кровь фильтруют через марлю и консервируют стрептомицином из расчета 1 г препарата, растворенного в 10-20 см стерильного 0,85%-ного раствора хлористого натрия, на 100 см крови. Консервированная кровь при хранении в холодильнике пригодна для использования, как правило, в течение 10-14 сут.

Гемолитическую систему готовят перед каждой постановкой РСК. Для этого 2,5%-ную взвесь отмытых эритроцитов и раствор гемолитической сыворотки в рабочем разведении смешивают в равных объемах и при постановке РСК выдерживают в водяной бане при 37°С-38°С в течение 15-35 мин (в зависимости от объема и толщины стенок сосуда) при периодическом перемешивании, а при постановке РДСК — в холодильнике. При смешивании компонентов раствор гемолитической сыворотки вносят во взвесь эритроцитов.

Исследуемые и контрольные (бруцеллезная и негативная) сыворотки крови крупного рогатого скота в исходном разведении 1:5 инактивируют в день постановки реакции в водяной бане: для РСК — при 60°С-62°С в течение 30 мин (сыворотки крови ослов и мулов — 64°С-65°С, буйволов — 62°С-64°С, свиней — 58°С-60°С); для РДСК — сыворотки крови животных всех видов — при 63°С-64°С в течение 30 мин.

Рабочие разведения всех компонентов для РСК (РДСК) готовят перед постановкой реакции и проверяют их на антикомплементарные и гемотоксические свойства по следующей схеме, представленной в таблице 1.

Таблица 1 — Проверка антикомплементарных и гемотоксических свойств компонентов реакций

0,85%-ный раствор хлористого натрия

Комплемент в разведении 1:20

Гемолитическая сыворотка в рабочем разведении

Антиген в рабочем разведении

0,85%-ный раствор хлористого натрия

Водяная баня 10 мин при 37°С-38°С

Полная задержка гемолиза эритроцитов

В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и гемотоксическими свойствами.

7.5.4 Проведение исследования в РСК

При массовом исследовании постановку реакции проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном, при постановке в трех пробирках исследуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сывороток), (таблица 2).

Необходимые разведения сывороток готовят следующим образом:

— при массовом исследовании в одной пробирке к 0,05 см исследуемой сыворотки добавляют 0,2 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (разведение 1:5);

— при постановке реакции в трех пробирках в первую вносят 0,1 см исследуемой сыворотки, добавляют 0,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (разведение сыворотки крови 1:5 в объеме 0,5 см ) и смешивают. Из первой пробирки переносят 0,2 см во вторую пробирку и 0,1 см — в третью. В третью пробирку добавляют 0,1 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (разведение 1:10).

Инактивирование разведенных сывороток проводят в порядке, указанном в 7.5.3.3.

Сыворотку, 0,85%-ный раствор хлористого натрия и другие компоненты реакции вносят при помощи индивидуальных пипеток, (дозаторов), групповых дозаторов Флоринского или одноканальных пипеточных дозаторов с наконечником.

Постановку реакции проводят по схеме, представленной в таблице 2.

Таблица 2

При массовом исследовании

При исследовании в двух разведениях

пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение)

пробирки для каждой исследуемой сыворотки (разведение)

Водяная баня 30 мин при 58°С-65°С

Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С

Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С

Примечание — Допускается смешивание равных объемов рабочих разведений антигена и комплемента непосредственно перед внесением в пробирки.

При постановке реакции ставят следующие контроли:

— негативной и бруцеллезной сывороток в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (по схеме реакции);

— гемолитической системы (0,4 см гемолитической системы и 0,6 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия) — полная задержка гемолиза;

— комплемента (0,2 см комплемента в рабочем разведении, 0,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия и 0,4 см гемолитической системы) — полный гемолиз;

— антигена (0,2 см антигена в рабочем разведении, 0,2 см комплемента в рабочем разведении, 0,2 см 0,85%-ный раствор хлористого натрия и 0,4 см гемолитической системы) — полный гемолиз.

При необходимости определения титра исследуемых проб сыворотки, разведения готовят следующим образом: в пробирки первого ряда (разведение 1:5) вносят по 0,8 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия, 0,2 см пробы сыворотки и смешивают пипетированием. В пробирки третьего, четвертого, пятого и шестого рядов вносят по 0,2 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия. Пробы сыворотки из первого ряда пробирок вносят по 0,2 см в пробирки второго и третьего рядов. В пробирках третьего ряда сыворотку смешивают, получая разведение 1:10; 0,2 см разведения сыворотки вносят в пробирки четвертого ряда, смешивают, получая разведение 1:20, и так далее до шестого разведения 1:80. Из пробирок последнего ряда по 0,2 см разведений сыворотки удаляют. В пробирки второго ряда вносят по 0,2 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (ряд без внесения антигена — контроль антикомплементарных свойств сыворотки). Постановку реакции проводят по схеме, представленной в таблице 2.

7.5.5 Реакция длительного связывания комплемента на холоде (РДСК)

7.5.5.1 Подготовка к исследованию

Сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и в разведении 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сыворотки), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном. Инактивирование разведенных сывороток крови и приготовление гемолитической системы проводят по 7.5.3.3.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1:25 или 1:20 при титре 0,06-0,1 или в разведении 1:20-1:15 при титре 0,1-0,14.

Одновременно определяют титр гемолитической системы с использованием свежей или консервированной сыворотки по схеме, приведенной в таблице 3.

Учет результатов титрования проводят немедленно после выемки штатива из водяной бани.

Таблица 3

Водяная баня 30 мин при 63°С-64°С

Холодильник 16-18 ч при 2°С-6°С

Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С

7.5.5.2 Проведение исследования

Внесение компонентов и последовательность постановки реакции проводят по схеме, приведенной в таблице 4.

Таблица 4

При массовом исследовании

При исследовании в трех пробирках

пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение)

пробирки для каждой исследуемой сыворотки (разведение)

0,85%-ный раствор хлористого натрия

Водяная баня 30 мин при 63°С-64°С

0,85%-ный раствор хлористого натрия

Антиген в рабочем раведении

Комплемент в рабочем разведении

Холодильник 2-6°С 16-18 ч и 20 мин при комнатной температуре

Гемолитическая система в рабочей дозе

Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С

При постановке реакции ставят контроли:

— негативная и бруцеллезная сыворотки в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и в разведении 1:5 без антигена;

— гемолитическая система в рабочей дозе без сыворотки, антигена и комплемента (0,6 см гемолитической системы и 0,6 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия) — полная задержка гемолиза;

— антиген с 0,85%-ным раствором хлористого натрия и гемолитической системой (0,2 см антигена в рабочем разведении; 0,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия и 0,6 см гемолитической системы) — полная задержка гемолиза.

7.5.6 Обработка результатов РСК и РДСК

Реакцию связывания комплемента и реакцию длительного связывания комплемента учитывают визуально. При постановке реакции в одной пробирке (при массовом исследовании) учет проводят один раз — сразу после извлечения штативов из водяной бани. При исследовании в трех пробирках — через 3-4 ч, когда в контрольных пробах с бруцеллезной сывороткой эритроциты осядут на дно пробирки, или на следующий день (в этом случае штативы с пробирками оставляют в холодильнике).

Результаты реакции оценивают в крестах по следующей схеме:

«++++» (четыре креста) — отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная и бесцветная, осадок 100% эритроцитов на дне пробирки;

«+++» (три креста) — гемолиз 25% эритроцитов, осадок 75% эритроцитов;

«++» (два креста) — гемолиз 50% эритроцитов, осадок 50% эритроцитов;

«+» (один крест) — гемолиз 75% эритроцитов, осадок 25% эритроцитов;

«-» (минус) — гемолиз 100% эритроцитов, осадок эритроцитов отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.

Степень гемолиза эритроцитов при необходимости определяют по шкале, которую готовят перед учетом реакции. Для этого из штатива выбирают пять пробирок с полным гемолизом, сливают их содержимое в одну и разводят по схеме, представленной в таблице 5.

Таблица 5

Процент гемолиза эритроцитов в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со шкалой.

Реакцию считают:

— положительной — при задержке гемолиза на два-четыре креста в одном или в двух разведениях сыворотки (1:5 или 1:10) и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);

— сомнительной — при задержке гемолиза с оценкой в один крест в одном или двух разведениях сыворотки и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);

— отрицательной — при полном гемолизе эритроцитов в двух или трех пробирках.

7.6 Реакция иммунодиффузии (РИД) с О-полисахаридным антигеном (О-ПС)

7.6.1 Сущность метода состоит в выявлении бруцеллезных антител, основанном на способности антител и антигена диффундировать в агаровом геле и при взаимодействии образовывать комплекс антиген-антитело, наблюдаемый в виде линии преципитации.

7.6.2 Приготовление 0,8%-ного агар-агара и подготовка чашек Петри

Для приготовления 200 см агара 17 г хлористого натрия и 1,6 г микробиологического агар-агара переносят в стеклянную колбу вместимостью 500 см , добавляют 200 см дистиллированной воды.

Колбу закрывают непромокаемым материалом (пергаментной бумагой, фольгой и т.п.) и помещают на водяную баню, которую также накрывают для предотвращения испарения воды при кипении водяной бани. Для полного расплавления агара колбу выдерживают в водяной бане в течение 35-45 мин с момента закипания воды. В чашки Петри, помещенные на горизонтальную поверхность, вносят по 14-18 см расплавленного агара. Чашки оставляют в течение 1 ч с приоткрытыми крышками. После застывания агара чашки Петри закрывают крышками и помещают в холодильник при температуре от 2°С до 8°С, хранят не более 5 сут.

При помощи штампа в геле агара делают отверстия (лунки). В каждой чашке прорезают не менее шести семилуночных розеток, каждая из которых состоит из семи лунок: одна лунка в центре диаметром 3 мм, остальные шесть лунок диаметром 5 мм по окружности, расстояние между центральной и периферическими лунками — 3 мм. Образовавшиеся диски геля удаляют из лунок канюлей, соединенной с вакуумным или водоструйным насосом (или любым другим способом).

7.6.3 Проведение исследования

7.6.3.1 В РИД с О-ПС антигеном исследуют на бруцеллез сыворотку крови крупного и мелкого рогатого скота и северных оленей с целью дифференциации животных, инфицированных от вакцинированных; для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе иерсиниями.

Для исследования используют сыворотки крови животных неконсервированные и консервированные. Не консервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при температуре от 4°С до 8°С. Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут; замороженные сыворотки — в течение 3 сут после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.

7.6.3.2 Реакцию иммунодиффузии проводят в чашках Петри. В центральную лунку вносят 0,02 см О-ПС антигена, а в периферические — по 0,04 см исследуемых сывороток крови.

На каждой чашке Петри ставят контроль с положительной бруцеллезной сывороткой (преципитирующей).

После внесения компонентов чашки Петри закрывают крышками и помещают во влажную камеру (эксикатор) и выдерживают при температуре от 18°С до 26°С.

7.6.4 Обработка результатов

7.6.4.1 Учет результатов проводят визуально в косом проходящем свете с помощью осветителя через 24 и 48 ч после постановки реакции.

Линии преципитации между лунками с антигеном и исследуемой сывороткой, сформировавшиеся через 24 ч, свидетельствует о положительной реакции.

Сыворотки крови, давшие линию преципитации через 48 ч, подлежат повторному исследованию.

Линии преципитации, сформировавшиеся через 24 или 48 ч при повторном исследовании, свидетельствуют о положительной реакции.

При получении положительного результата в реакции иммунодиффузии, животное признают больным бруцеллезом.

7.6.4.2 Применение РИД с О-ПС антигеном при диагностике бруцеллеза

а) крупного рогатого скота в случаях:

1) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых не применяли вакцины против бруцеллеза, исследуют сыворотки крови животных, сомнительно или положительно реагирующие в РА и (или) РСК (РДСК);

2) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых животных вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:

— для контроля эпизоотического состояния по бруцеллезу животных не ранее чем через 1,5 мес после вакцинации;

— для дифференциации положительных реакций, полученных в РА (не выше 200 ME) или (и) РСК (РДСК) не выше чем в разведении 1:10 по истечении 6 мес после введения вакцины;

3) в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых животных вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:

— через 1,5 мес и далее один раз в месяц в течение 6 мес после иммунизации или реиммунизации с целью раннего выявления больных бруцеллезом животных;

— через 6 мес после иммунизации (реиммунизации) для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе мероприятий, предусмотренных по профилактике и борьбе с бруцеллезом;

б) северных оленей в случаях:

1) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых противобруцеллезные вакцины не применяют. Исследуют сыворотки крови животных, сомнительно или положительно реагирующие в РА и (или) РСК (РДСК);

3) в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:

— через 1,5 мес и далее один раз в месяц в течение 6 мес после иммунизации или реиммунизации с целью раннего выявления больных бруцеллезом животных;

— через 6 мес после иммунизации (реиммунизации) для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе мероприятий, предусмотренных по профилактике и борьбе с бруцеллезом;

1) в благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах, где противобруцеллезные вакцины не применяют:

— при исследовании сыворотки крови животных, сомнительно и положительно реагирующих в РА или (и) РСК (РДСК);

2) в благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах, где проводится иммунизация животных противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами:

— для дифференциальной диагностики бруцеллеза овец и коз не ранее чем через 5 мес, только после однократной их иммунизации противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами;

— для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе и иерсиниями;

3) в неблагополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах:

— с целью более раннего выявления больных бруцеллезом животных не ранее чем через 5 мес, только после однократной иммунизации противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами;

— при снятии ограничений с неблагополучных по бруцеллезу хозяйств одновременно с РБП или РА, РСК (РДСК).

7.7 Реакция иммунодиффузии (РИД) с R -бруцеллезным антигеном при диагностике бруцеллеза собак, вызываемым B.canis

7.7.1 Подготовка к исследованию

7.7.1.1 Приготовление 0,85%-ного раствора хлористого натрия

В 1 дм дистиллированной воды растворяют соответственно 8,5 г хлористого натрия. Растворы фильтруют дважды через бумажный фильтр. Растворы хранят в стеклянных бутылях, укупоренных резиновыми пробками при температуре от 2°С до 20°С и используют в течение 1 мес.

7.7.1.2 Приготовление 0,8%-ного геля агара по 7.6.2

7.7.1.3 Пробы сыворотки крови от собак исследуют в РИД в свежем или консервированном виде.

7.7.2 Проведение исследования

Для постановки реакции иммунодиффузии используют биологические чашки Петри разного диаметра. Для исследования до четырех проб — диаметром 40 мм, для исследования 6-40 проб — диаметром 90 мм.

В центральную лунку геля вносят 0,02 см антигена, в периферические — по 0,04 см исследуемых проб сыворотки крови.

В каждой чашке ставят контроль антигена с негативной и R -бруцеллезной сывороткой для РИД.

Внутрь крышки каждой чашки вкладывают фильтровальной бумагу, вырезанную по размеру ее наружного диаметра, которую увлажняют фенолизированным 0,85%-ным раствором хлористого натрия. Чашку плотно прикрывают крышкой и оставляют при температуре от 18°С до 26°С.

7.7.3 Обработка результатов — по 7.6.4.

7.8 Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

7.8.1 Сущность метода

Метод основан на выявлении бруцеллезным эритроцитарным антигеном специфических антител в сыворотке крови больных бруцеллезом животных или иммунизированных вакцинами против бруцеллеза животных.

7.8.2 Подготовка к исследованию

7.8.2.2 Приготовление хромовой смеси

В фарфоровую чашку вместимостью 300-500 см помещают 5 г тонкоизмельченного в фарфоровой ступке двухромовокислого калия или 6 г бихромата натрия, добавляют 100 см концентрированной технической серной кислоты и осторожно нагревают на водяной бане до полного растворения двухромовокислого калия (бихромата натрия). Хромовую смесь хранят при комнатной температуре до момента изменения цвета с темно-оранжевого до темно-зеленого.

7.8.2.3 Подготовка планшетов

Планшеты подготавливают к работе следующим образом: новые, погружают на 20-30 мин в теплый раствор с моющим средством и каждую лунку моют в этом растворе вращательным движением ватной или ватно-марлевой пробки. Ершом не пользуются, во избежание повреждения поверхности лунки. Затем планшеты не менее 6 раз промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и сушат при комнатной температуре или в термостате.

Допускается обработка планшетов хромовой смесью в течение одних суток, затем их промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и сушат.

При работе лицо, руки, одежду защищают от попадания хромовой смеси.

Реакцию ставят на 0,85%-ном растворе хлористого натрия. Сыворотку бруцеллезную сухую регидратируют дистиллированной водой или 0,85%-ным раствором хлористого натрия.

7.8.3 Проведение исследования

Крупный рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, исследуют в сроки, предусмотренные инструкциями по применению вакцин.

Мелкий рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, в РНГА не исследуют.

Реакцию ставят с использованием набора для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота для РНГА.

Реакцию проводят в объеме 0,55 см (0,5 см разведения сыворотки и 0,05 см антигена) в пробирках Флоринского.

При массовых исследованиях постановку реакции можно проводить с использованием исследуемых сывороток в одном (исходном) разведении. После прогревания исследуемые и контрольные сыворотки по 0,25 см вносят в лунки планшетов и добавляют в них по 0,25 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.

В каждую лунку с разведением сыворотки вносят по 0,05 см антигена в рабочем разведении.

Содержимое лунок перемешивают до получения равномерной взвеси антигена в сыворотке, выдерживают при температуре от 18°С до 26°С в течение 3-4 ч и проводят учет реакции.

Сыворотки от неиммунизированного или иммунизированного неагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами крупного рогатого скота исследуют с разведения 1:50. Исходное разведение 1:25 готовят путем внесения 0,1 см сыворотки в пробирки, содержащие 2,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.

Сыворотки от крупного рогатого скота, иммунизированного агглютиногенными противобруцеллезными вакцинами, исследуют с разведения 1:100. Исходное разведение 1:50 готовят путем внесения 0,1 см сыворотки в пробирку с 4,9 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия или по 0,05 см сыворотки и 2,45 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия, если используются пробирки вместимостью до 5 см .

Сыворотки от мелкого рогатого скота исследуют с разведения 1:25. Исходное разведение 1:12,5 готовят путем внесения 0,2 см сыворотки в пробирки, содержащие 2,3 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.

Одновременно с исследуемыми сыворотками аналогично готовят разведения контрольных сывороток: бруцеллезной и негативной.

Исследуемые и контрольные сыворотки в исходных разведениях в пробирках выдерживают в водяной бане, нагретой до 60°С-62°С в течение 30 мин.

При получении положительного результата исследования сыворотки крови животных в одном разведении, для определения титра гемагглютининов в РНГА постановку реакции проводят в четырех разведениях, при этом исходное разведение каждой сыворотки готовят заново.

Все сыворотки (исследуемые и контрольные) проверяют на отсутствие гемагглютинирующих свойств.

В лунки первого, второго, третьего и четвертого рядов планшета вносят по 0,5 см и пятого ряда по 0,25 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.

В лунки первого ряда добавляют по 0,5 см , а в лунки пятого ряда по 0,25 см исследуемых и контрольных сывороток в исходном разведении. После смешивания путем пипетирования по 0,5 см разведенных сывороток из лунок первого ряда переносят в лунки второго ряда, из лунок второго — в лунки третьего, из лунок третьего — в лунки четвертого, из лунок четвертого ряда по 0,5 см разведенных сывороток удаляют.

Во все лунки первых четырех рядов с разведенными сыворотками добавляют по 0,05 см антигена в рабочем разведении, которое готовят путем смешивания равных объемов антигена и 0,85%-ного раствора хлористого натрия. В лунки пятого ряда вносят 0,05 см взвеси несенсибилизированных эритроцитов в рабочем разведении (один объем несенсибилизированных эритроцитов + один объем 0,85%-ного раствора хлористого натрия).

Содержимое лунок перемешивают путем легкого постукивания по краю планшета до получения равномерной взвеси антигена в сыворотке, выдерживают при температуре от 18°С до 24°С в течение 3-4 ч и проводят учет реакции.

Результат контроля на самоагглютинирующие свойства исследуемых и контрольных сывороток должен быть отрицательным.

Допускается постановка реакции в два этапа: накануне готовят исходные разведения исследуемых и контрольных сывороток крови, прогревают при указанном выше режиме, хранят при температуре от 2°С до 8°С и на следующий день исследуют.

После постановки реакции планшеты выдерживают в 1%-ном растворе хлорамина или другом антисептическом растворе 1,5-2,0 ч. Впоследствии их моют, как указано выше.

7.8.4 Обработка результатов

Реакции учитывают визуально и оценивают в крестах по следующей схеме:

«++++» (четыре креста) — 100%-ная агглютинация эритроцитов, агглютинат в виде хорошо выраженного «зонтика» покрывает все дно лунки, возможно сползание и заворачивание краев агглютината в виде «зонтика»;

«+++» (три креста) — 75%-ная агглютинация эритроцитов, агглютинат в виде хорошо выраженного «зонтика» меньшего диаметра, чем при оценке реакции на четыре креста. В центре лунки возможно образование с трудом различаемого кольца из осевших неагглютинированных эритроцитов;

«++» (два креста) — 50%-ная агглютинация эритроцитов, осевшие неагглютинированные эритроциты образуют на дне лунки ровное кольцо с зернистостью вокруг него;

«+» (один крест) — на дне лунки кольцо коричнево-красного цвета;

«-» (минус) — эритроциты оседают в виде компактной «пуговки» или колечка.

За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация эритроцитов с оценкой четыре или три креста. Реакции с оценкой два креста («++»), один крест («+») и минус («-«) считают отрицательными.

7.9 Иммуноферментный анализ (ИФА)

Сущность метода заключается в выявлении в образце сыворотки крови животных иммуноглобулинов класса G к бактериям рода Brucella.

7.9.1 Подготовка к исследованию

7.9.1.2 Приготовление рабочего раствора ФСБ-Т

ФСБ-Т — концентрированный раствор буфера (флакон N 1) разводят в 25 раз дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Для этого содержимое одного флакона концентрата в объеме 26 см переносят в мерную колбу и доводят объем до 650 см дистиллированной водой. Если в концентрате присутствуют кристаллы, то его перед разведением нагревают и тщательно взбалтывают. В случае использования одного или нескольких стрипов планшета в чистый флакон отбирают необходимое для данного исследования количество составных частей ФСБ-Т в соответствии с таблицей 6.

Таблица 6 — Разведения ФСБ-Т

источник