Меню Рубрики

Бруцеллез материал для исследования

Возбудители бруцеллеза (Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis и Brucella canis) высоко контагиозны и работа с ними проводится в специализированных лабораториях особо опасных инфекций. Постановку серологических реакций и аллерги­ческих проб для диагностики бруцеллеза производят соответственно в обычных микробиологических лабораториях и больничных условиях.

Главным резервуаром бруцелл являются домашние сельскохозяйственные животные, а также другие виды животных, от которых человек заражается преимущественно контактным или контактно-бытовым, реже алиментарным путем. Клинические проявления бруцеллеза многообразны, поражаются лимфатическая, сосудистая, гепато-лиенальная системы и особенно опорно-двигательный аппарат Методы микробиологической диагностики бруцеллеза представлены в схеме 7.

Схема 7. Микробиологическая диагностика бруцеллеза

Материал: кровь, костный мозг, моча, испражнения, грудное молоко у кормящих женщин

Серологический метод— постановка РА с сывороткой крови больного (реакция Райта, ставят в начале 2-й недели болезни, диагностический титр 1:200 и выше), ускоренной РА на стекле (реакция Хеддльсона), РСК и ИФА.

Диагностикумом в реакции Райта и Хеддльсона является взвесь убитых бруцелл с красителем генциановым фиолетовым или метиловым фиолетовым.

Реакцию агглютинации Хеддльсона ставят на стеклянной пластинке, на которую наносят микропипеткой неразведенную исследуемую сыворотку в количествах 0,08; 0,04; 0,02; 0,01 и 0,02 мл, добавляют по 0,03 мл бруцеллезного диагностикума, кроме по­следней дозы, в которую вносят 0,03 мл ФР (контроль сыворотки). Контролем диагностикума является смесь из 0,03 мл антигена и 0,03 мл ФР. Все капли перемешивают стеклянной палочкой или бактериологической петлей и после легкого покачивания стекла наблюдают за появлением мелкозернистого окрашенного агглютината. Отсутствие агглюти­нации во всех пробах сыворотки оценивается как отрицательная реакция, наличие агглютинации в 1-й пробе (0,08 мл сыворотки) — сомнительная, во 2-й (0,04 мл) — слабоположительная, в 3-й или 4-й пробах (0,02-0,01 мл) — положительная, во всех пробах — рез­ко положительная реакция. Поскольку реакция агглютинации Хеддльсона иногда бывает положительной у здоровых людей за счет нормальных антител, она обязательно подтверждается реакцией Райта.

РИФ, РНГА, РСК и особенно ИФА более чувствительны, чем реакция агглютинации. Для ранней диагностики бруцеллеза особую ценность имеет ИФА, позволяющий выявить в сыворотке больных антибруцеллезные антитела класса IgM,которыев отличие от IgG по­являются в ранние сроки болезни, свидетельствуя о свежем инфицировании.

Аллергический метод –постановка внутрикожной аллергической пробы Бюрне с 15-20 дня заболевания. Учет реакции проводится через 24-48 часов, положи­тельной считается реакция в случае появления на месте введения аллергена (бруцеллина) болезненности, гиперемии и инфильтрации кожи диаметром 3 см и более. Положительная аллергическая ре­акция на бруцеллин сохраняется в течение длительного времени после перене­сенного бруцеллеза, а также после прививки.

Бактериологический метод— посев крови для выделения гемокультуры в 2 флакона с 50 мл печеночного или асцитического бульона (рН 7,1-7,2) или МПБ с добавлением 1 % глюко­зы, 2 % глицерина и антифаговой сыворотки (для инактивации бруцеллезного бактериофага) в первые дни болезни при наличии лихорадки. При отрицательных резуль­татах исследование повторяют, т.к. бактериемия наблю­дается в течение 1 года и более.

Один флакон выращивают в обычных аэробных условиях, другой — в герметично закрытом сосуде с 10 % углекислого газа (или СО2-инкубаторе) при температуре 37 0 С до 1 ме­сяца, делая пересевы на скошенный пече­ночный агар или эритрит-агар каждые 4-5 дней. На жидких средах бруцеллы растут с образованием легкого помутнения и небольшого слизистого осадка, на плотных средах в виде округлых, диаметром до 5 мм, серовато-белых, блестя­щих, прозрачных с янтарным оттенком в проходящем свете колоний. Типичные колонии пересевают на скошенный агар и идентифицируют выделенную культуру до уровня вида.

Выполняются также посевы ис­следуемого материала в желток свежего куриного яйца или в жел­точный мешок куриного эмбриона с последующей их инкубацией в течение 5 дней при 37 0 С и пересевом содержимого желточного мешка на плотные и жидкие питательные среды для выделения чистой культуры бруцелл.

Бруцеллы идентифицируют на основании изучения морфологических (рис. 13 — грамотрицательные коккобактерии), культуральных, биохимических (они не ферментируют уг-

Рис. 13. Возбудитель бруцеллеза (Brucella melitensis). Окраска по Граму. Мелкие грамотрицательные коккобактерии.

леводы, не свертывают молоко и не разжижают желатину, выделяют сероводород), антигенных свойств (постановка РА с моноспеци­фическими сыворотками против антигеновА, М, R), чувствительности к специфическому бактери­офагу и бактериостатическому действию анилиновых красителей (табл. 8).

Таблица 8.Дифференциация основных видов бруцелл

Признак Вид бруцелл
Br. melitensis Br. abortus Br. suis
Условия культивирования аэробные 10% СО2 аэробные
Рост на средах с красителями:
фуксином 1:50000 + +
тионином 1:25000 + +
пиронином 1:200000 + +
Образование Н2S ± ±
РА с монорецепторными сыворотками
А ± ± +
М ± ± ±
Чувствительность к бруцеллезному фагу + ±

. Обозначения: «-« — отрицательная; «+» — положительная; «±» — непостоянная реакции.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Наиболее часто для бактериологического исследования на бруцеллез отсылают абортированный плод (выкидыш) или его органы, реже плаценту, околоплодную жидкость или плодные оболочки, молоко (молозиво), содержимое полости рогов матки, гигром, абсцессов, слизь или выделения из влагалища.

Нередко направляют на исследования все внутренние органы, трубчатую кость и измененные лимфатические узлы убитых с диагностической целью животных на санитарных бойнях.

Плод. Наиболее полное бактериологическое исследование может быть произведено при обследовании цельного плода. В этом случае рост бруцелл на питательных средах получается, как правило, в чистой культуре, а засеянные среды могут выдерживаться в термостате до месяца без развития на них посторонней микрофлоры. Одновременно могут быть произведены посевы из цельного плода для исследования на другие инфекционные заболевания, в частности на вибриоз, паратифозный и вирусный аборты, листериоз и трихомоноз (для крупного рогатого скота). Плод должен отсылаться в водонепроницаемой таре, лучше в замороженном состоянии (в летнее время применять сухой лед). При отсутствии льда плод отсылают с нарочным, специально проинструктированным, с таким расчетом, чтобы он был доставлен в лабораторию не позже суток после аборта. В целях предупреждения рассеивания инфекции плод накрывают марлевыми салфетками, пропитанными 2%-ным раствором едкого натра, 2%-ным раствором фенола или другим дезинфицирующим раствором.

Вместо цельного плода могут быть отосланы его органы, например желудок (с преджелудками), селезенка, трубчатая кость, печень, почки, легкое. Чаще бруцеллы выделяются из содержимого желудка

и селезенки. Перед экстирпацией желудка перевязывают 12-перстную кишку и пищевод на расстоянии 10—15 см от желудка. При отсылке отдельных органов нужно соблюдать такие же предосторожности, как и при отправке плода.

Посев из абортированных плодов или их органов производят на плотный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (ППГГА) без добавления в него красок. Могут быть сделаны посевы на косой агар в пробирки или в бактериологические чашки. Среды используют свежие в день их приготовления или давностью не более трех суток, выдержанные в холодильнике.

Посевы производят из содержимого сычуга (желудок), из селезенки, печени, костного мозга (трубчатая кость), легких, сердца (кровь), почек. Из сычуга и сердца посевы производят путем забора материала стерильной пастеровской пипеткой из глубины органа через фламбированный раскаленным шпателем участок ткани. Таким же образом засевают среды материалом из других органов, если ткань этих органов размягченная. Для засева материала из плотных тканей отбирают участки в местах локализации мелких белесоватых или желтоватых узелков или кровоизлияний, фламбируют шпателем, вырезают стерильным пинцетом кусочки массой 1—3 г, помещают в стерильную ступку с песком или в дробитель ткани, растирают в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия в соотношении 1 : 10 и производят штриховые посевы.

Трубчатую кость распиливают поперек костной пилой, стерилизуют поверхность распила над пламенем спиртовки, пастеровской пипеткой берут из глубины костный мозг и делают штриховые посевы на средах.

Из каждого органа производят посевы на 2—3 чашки или засевают такое же количество пробирок. Из содержимого желудка телят и ягнят делают мазки на предметном стекле для окраски бруцелл по Козловскому или Граму. Для обнаружения вибрионов мазки лучше красить карболовым фуксином Циля, разведенным 1 : 5.

Ввиду возможной миграции Br. melitensis на крупный рогатый скот, а также в целях выделения некоторых биотипов Br. abortus следует производить культивирование засеянных пробирок или чашек в эксикаторах с пониженным содержанием кислорода и в обычных атмосферных условиях.

При культивировании посевов в микроанаэростатах дозирование углекислого газа осуществляют путем создания отрицательного давления, вследствие чего происходит засасывание в полость прибора нужного количества углекислого газа (10—15%). В обычных эксикаторах можно получить необходимое содержание СO2 путем сжигания в них ваты, но в данном случае эксикатор нужно загружать пробирками или чашками не более половины его вместимости. Крышки эксикаторов должны быть хорошо отшлифованы. Проверку их герметичности производят ежедневно в течение 6—8 дней культивирования и при необходимости герметичность восстанавливают. Посевы выдерживают в термостате при 37,5—38,5° С в течение 25—30 дней, хотя рост бруцелл в большинстве случаев обнаруживается на 3— 8-й день культивирования.

Матка. Истечения из матки абортировавшего животного берут для бактериологического исследования в первые дни после выведения плода. Для получения этого материала животное фиксируют, раскрывают влагалище влагалищным зеркалом с осветителем, вводят при помощи корнцанга стерильный тампон в область шейки матки и собирают ее содержимое. При частично закрытой шейке матки делают попытку раскрыть ее путем массирования влагалища через прямую кишку. Если из рога матки жидкость не поступает, то в ее полость через шейку матки вводят 100—200 мл стерильного изотопического раствора хлорида натрия через катетер или резиновую трубку с наконечником, соединенные на другом конце со 100-граммовым шприцем. Через 1—2 мин, не вынимая трубки, получают смыв в шприц, переливают его в стерильный сосуд и отправляют в лабораторию.

Молоко. Перед взятием проб молока вымя коровы обмывают теплой водой с мылом и вытирают чистым полотенцем. Затем соски протирают марлевым тампоном, смоченным 75%-ным спиртом или 1%-ным раствором борной кислоты. Первые 2—3 струи молока из каждой четверти вымени собирают в отдельную посуду и обезвреживают кипячением. После этого в стерильные широкие пробирки из каждой четверти вымени надаивают приблизительно 15—20 мл молока. Можно брать после доения последние порции молока и быстро выдаивать одну струю непосредственно в пробирки или чашки с плотной питательной средой (ППГГА), содержащей ингибиторы.

Отобранные порции молока из каждой четверти вымени центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин и вводят морским свинкам заражающую дозу из верхнего слоя (сливки) и осадка. Этот же материал высевают на плотную среду с краской. В пробирках, поступивших в лабораторию с посевом, сделанным на месте, заменяют пробки и обрабатывают пробирки спиртом. Посевы культивируют в обычных атмосферных условиях при содержании в эксикаторе 10—15% СO2. Молоко коров исследуют несколько раз с интервалом 5-10 дней.

Плацента, плодные оболочки. Для бактериологического исследования отбирают участок плаценты с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на ее поверхности фибрина или гнойного экссудата. Как и плод, части плаценты или плодных оболочек следует отсылать в лабораторию в замороженном виде, соблюдая при этом указанные выше меры предосторожности.

В лаборатории поверхность плаценты обрабатывают тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором, просушивают сухими тампонами, прижигают шпателем, вырезают участки, предназначенные для исследования, размельчают в условиях стерильности, как это указано для органов плода, и засевают на плотную среду с ингибиторами. Кусочки плаценты (размером приблизительно 0,5 X 0,5 см) рекомендуется опускать перед размельчением на 1—2 с в кипящую воду. Из мест с хорошо выраженной отечностью посев может быть произведен непосредственно пастеровской пипеткой.

Аналогично проводят посевы из плодных оболочек. Более результативными, однако, бывают посевы, сделанные из амниотической жидкости на плотные среды.

Содержимое гигром, абсцессов и других полостей. Для получения содержимого патологической полости делают стерильно пункцию ее стенки иглой со шприцем. Пересылают пунктат в лабораторию в термосах со льдом. Посевы производят на плотные среды с ингибиторами.

Кровь. Посев крови делают в колбы вместимостью 200—250 мл, содержащие 100 мл жидкой питательной среды. На 100 мл среды добавляют 20 мл крови, взятой стерильно из яремной вены. Для посева крови используют среду Первушина, бульон альбими, трнптозный бульон, МПБ, содержащий 1% глюкозы и 2—3% глицерина.

Посевы крови от крупных животных лучше делать в колбы со средами непосредственно из вены. Для этой цели в ватную пробку колб, содержащих среду, монтируют тонкую резиновую трубку, конец которой соединяют с кровопускательной иглой. Всю систему, кроме иглы, стерилизуют завернутой в бумагу. Иглу стерилизуют отдельно. Взятие крови проводят стерильно. Посевы крови можно делать непосредственно в пробирки, подготовленные таким же образом.

Хорошие результаты получаются при высевах крови на комбинированные среды. В колбы вначале вводят плотную среду (ПГ1ГГА). После затвердения скошенного, агара в колбу вводят одну из указанных выше жидких сред в таком количестве, чтобы более половины плотной среды не покрывалось жидкой средой. Затем в колбу вводят свежевзятую стерильно кровь или делают посев крови непосредственно из яремной вены, как указано выше. Культивирование продолжается до 1 мес. Периодически раз в 3—4 дня контролируют рост бруцелл. При посевах на жидкие среды периодически производят отсев на косой плотный агар (ППГГА). При комбинированном методе отсевы не требуются.

По данным отечественной литературы, гемокультуры бруцелл успешно могут быть получены на куриных эмбрионах. Ряд иностранных авторов также рекомендует этот метод. Кровь, стерильно взятую в небольшом количестве (0,1—0,3 мл), вводят нескольким эмбрионам 4—7-дневного возраста в аллантоисный мешок (желток). Посев производят при просвечивании яиц. Место укола обрабатывают спиртом и смазывают спиртовым раствором йода, после извлечения иглы отверстие в скорлупе заливают парафином. Инкубация длится (при 37,5—38,5° С) 5—6 сут. Затем из желточного мешка делают посевы на плотную питательную среду. Н. Д. Анина-Радченко и Н. Ф. Браславец (1952) даже такой загрязненный материал, как мочу и гной, предварительно засевали в куриные эмбрионы и получили хороший результат. Они считают, что прямой посев на питательные среды в четыре раза менее эффективен по сравнению с методом предварительного инкубирования в курином яйце.

Читайте также:  Акт на бруцеллез крс образец

Моча. Для исследования мочу берут стерильно мочевым катетером в количестве 75—100 мл. Пробу мочи в количестве 50 мл центрифугируют при 2000—3000 об/мин в течение 10—20 мин. Жидкость над осадком удаляют, а из осадка готовят взвесь в 0,3—0,5 мл МПБ и засевают на плотную среду с ингибиторами.

Кал. К исследованию кала у животных прибегают редко. Пробы вежевзятого кала массой 1 г суспензируют в 50 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия и фильтруют через несколько слоев марли для удаления грубых частиц. Затем фильтрат центрифугируют при 1000—2000 об/мин в течение 3—5 мин. Жидкость над осадком сливают в стерильную посуду, добавляют к ней гипериммунную бруцеллезную сыворотку в соотношении 1 : 100 и ставят и водяную баню (на 2 ч) или в термостат (на 3—4 ч) при температуре 37—38° С. Затем жидкость центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляют, осадок взвешивают в стерильном изотоническом растворе и снова центрифугируют в течение 5 мин. Эту манипуляцию повторяют дважды, после чего осадок заседают на плотный агар с генцианвиолетом (1 : 200000) в бактериологические чашки или пробирки. Этим же материалом могут быть заражены морские свинки.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

источник

Бруцеллы (род Brucella) – возбудители бруцеллеза человека и животных. В. melitensis, В. abortus и В. suis – вызывают заболевание у человека; B. ovis, B. canis, B. neotomae заболевания человека не вызывают.

Морфология, физиология. Мелкие Гр– коккобактерии размером 0,5-0,7х0,6-1,5 мкм. Также могут быть палочковидной формы; в мазках обычно расположены беспорядочно. Жгутиков не имеют. Спор не образуют. Свежевыделенные штаммы могут образовывать нежную капсулу при культивировании на средах, содержащих 10% иммунной сыворотки барана или лошади, а также при выращивании на куриных эмбрионах.

Требовательны к питательным средам. Для выращивания обычно применяют триптозный, триптозо-казеиново-соевый и кровяной (5% овечьей крови) агары; оптимальная среда для культивирования — печёночный агар Хеддльсона. Выделяемые из организма больных они размножаются очень медленно, рост может быть обнаружен только через 1–3 недели после посева исходного материала. Многократное пересевание в лабораторных условиях делает культуры способными расти в течение 1–2 дней. На плотных питательных средах образуют мелкие, выпуклые, бесцветные с перламутровым блеском колонии S-формы (жемчужины), легко переходят в мукоидную и шероховатую. В жидких средах возникает равномерное помутнение. Под влиянием антибиотиков образуют L-формы.

Бруцеллы строгие аэробы, а В. abortus в первых поколениях требует увеличенной концентрации (5–10%) СО2.

БХ: расщепляют глюкозу и некоторые другие углеводы, разлагать мочевину и аспарагин, гидролизовать белок, пептоны, аминокислоты, выделять каталазу, гиалуронидазу, пероксидазу, липазу, фосфатазу и другие ферменты. Внутри видов бруцелл различают биовары. Их дифференциация основана как на биохимических различиях, так и на способности расти на средах с фуксином и тионином, лизабельности фагом Т6, агглютинабельности моноспецифическими сыворотками.

АГ. Содержат поверхностно расположенный Vi-АГ и соматические видоспецифические АГ А и М, количественное соотношение которых различно у разных видов. У В.melitensis преобладают М-АГы. у В. abortus и В. suis – А-АГ. Для идентификации бруцелл по антигенным свойствам используют реакцию адсорбции агглютининов или монорецепторные сыворотки.

Экология и распространение. Зоонозная инфекция. Возбудители разных видов циркулируют среди животных, от которых заражаются и люди. В.melitensis вызывает заболевания мелкого рогатого скота, В. abortus – КРС, В.suis – свиней. Непатогенные для человека

Бруцеллы устойчивы к действию факторов окружающей среды. Они длительно сохраняют жизнеспособность при низкой температуре. В почве, моче, испражнениях животных, больных бруцеллезом, в навозе, сенной трухе возбудители выживают 4–5 мес., в шерсти– 3– 4 мес., в пыли – 1 мес., в замороженном мясе – до 5 мес. К высокой температуре и дезинфицирующим веществам бруцеллы высокочувствительны: при 60°С погибают за 30 мин, при кипячении – мгновенно. Все дезинфектанты губят бруцелл в течение нескольких минут.

Патогенность и патогенез. Проникновение – алиментарным, контактным и воздушно-капельным путями. Алиментарный путь заражения связан с употреблением в пищу продуктов животноводства (масла, молока, мяса), полученных от больных животных. Контактным путем заражаются чаще ветеринары, зоотехники, работники мясокомбинатов при уходе за больными животными, обработке сырья. Заражение возможно при работе с инфицированной шерстью, ветошью, когда имеет место распыление, попадание бруцелл в воздух. Для человека наиболее патогенными являются В.melitensis – возбудитель болезни мелкого рогатого скота (овец, коз).

Выраженные инвазивные и агрессивные свойства бруцелл обусловливают способность возбудителя проникать в организм через неповрежденные слизистые оболочки. После проникновения в организм распространяются лимфогенным путем, попадают в кровь, а из крови – в селезенку, костный мозг, лимфоузлы, где, локализуясь внутриклеточно, могут длительно сохраняться.

Болезнетворность бруцелл определяется действием эндотоксина. Выделяющиеся ферменты (гиалуронидаза и др.) способствуют распространению микробов в тканях. В патогенезе бруцеллеза имеет значение способность возбудителя размножаться в клетках лимфоидно-макрофагальной системы.

С первых дней болезни возникает реакций ГЗТ, которая сохраняется в течение всей болезни и длительное время после выздоровления.

Иммунитет. В основе иммунитета при бруцеллезе лежит активность системы Т-лимфоцитов. Важную роль играет фагоцитоз и состояние аллергии. Обезвреживание бруцелл происходит при участии антител – опсонинов, агглютининов.

Лабораторная диагностика. Проводится бактериологическим и серологическим методами. Материалом для бактериологического исследования служат кровь, испражнения и моча больных, иногда – спинномозговая жидкость. Выделением возбудителя занимается специальная режимная лаборатория.

Образцы инкубируют в МПБ или бульоне Мартена (можно использовать соевый бульон) при 37°С. При проведении исследования засевают 2 порции среды и в одной создают повышенную концентрацию СО. Через 4-5 сут наблюдают рост бруцелл, нередко в виде мелких колоний, вкрапленных в тяжи фибрина; среда остаётся слегка мутной или прозрачной. После пересева на твёрдые среды отмечают характерный рост колоний, из которых отвивают чистые культуры с последующими идентификацией биохимических свойств, определением способности расти на средах с добавлением некоторых анилиновых красителей (бактериостатический метод Хеддльсона) и определением биотипа реакциями агглютинации.

Серологические исследования. Реакция агглютинации (реакция Райта) — один из основных методов диагностики бруцеллёза. Динамика реакции может быть различной, для неё характерно колебание титров в течение суток; положительная реакция с первого дня заболевания; наиболее высокие титры отмечают через 1-2 мес. Для получения адекватных результатов необходимо использовать негемолизированную сыворотку и Аг, приготовленный из S-форм бруцелл (применять Аг диссоциированных форм нельзя); в эндемичных очагах, вызванных Brucella melitensis, рекомендуют применять гомологичный Аг. Следует помнить, что для реакции Райта характерны проагглютинационные зоны, или прозоны (отсутствие агглютинации в первых разведениях и чёткое её проявление в более высоких разведениях сыворотки). Часто применяют микрометод реакции агглютинации на стекле (реакция Хеддльсона). В острой фазе заболевания диагностическую ценность имеет иммуноферментный метод, выявляющий IgM в сыворотке больного. Выявление неполных AT (реакция Кумбса) с применением антиглобулиновой сыворотки. Для диагностики, особенно при отрицательных результатах бактериологических и серологических исследований, используют аллергические кожные пробы (проба Бюрне), обычно положительные у 70-85% пациентов к концу 1 мес заболевания. В качестве Аг применяют бруцеллин (мелитин, абортин) — протеиновый экстракт культуры бруцелл. Пробу также применяют для проведения эпидемиологических обследований; бывает положительной после вакцинации.

Для выявления возбудителя в молоке широко применяется кольцевая проба Банга.

Профилактика и лечение. Общие и специфические мероприятия ветеринарной службы. Выявляют и ликвидируют бруцеллез среди сельскохозяйственных животных, обезвреживают продукты и сырье животного происхождения. Людей, подвергающихся опасности заражения, вакцинируют живой бруцеллезной вакциной. Лечение бруцеллёза затруднено внутриклеточным паразитизмом бруцелл, что защищает их от действия антимикробных препаратов и AT. Препаратами выбора считают тетрациклин и стрептомицин. В тяжёлых и упорных случаях можно назначить рифампин (рифамицин). Смертность без лечения может достигать 5-10%.

источник

1.1. Бруцеллез — инфекционная, хронически протекающая болезнь животных.

Возбудитель — бактерии из рода бруцелла, в который входят шесть самостоятельных видов: мелитензис (овец и коз), абортус (крупного рогатого скота), суис (свиней), канис (собак), овис (баранов и овец) и неотома (кустарниковых крыс).

Микроорганизмы первых четырех видов вызывают бруцеллез животных, а пятого вида — инфекционный эпидидимит баранов (ИЭ).

От животных, больных бруцеллезом, могут заражаться люди, для которых наиболее опасен возбудитель бруцеллеза овец и коз.

1.2. Диагноз на бруцеллез у животных ставят на основании результатов бактериологического, серологического, молекулярно-генетического и аллергического исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни, руководствуясь при этом санитарными и ветеринарными правилами по профилактике и борьбе с заразными болезнями, общими для человека и животных.

1.2.1. При установлении диагноза на бруцеллез необходимо учитывать следующее:

— различные виды возбудителя являются патогенными, в основном, для животных соответствующего вида. Бруцеллы видов мелитензис, абортус и суис могут мигрировать на животных других видов;

— клинические признаки бруцеллеза у животных не характерны. Наиболее часто клиническое проявление болезни у маточного поголовья — аборт, у свиноматок наблюдается мумификация плодов.

При абортах отмечается утолщение плодовых оболочек, образование на них фибринозных или гнойных хлопьев. Бруцеллез сопровождается нередко поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой системы (у самок — эндометрит, вагинит, у самцов — орхит, эпидидимит);

— патологоанатомическая картина при бруцеллезе не имеет характерных особенностей, позволяющих использовать их для диагностики этой болезни. Только у свиней на слизистой оболочке матки иногда находят желтовато-гнойные или казеозные узелки величиной с просяное зерно, так называемый «милиарный бруцеллез матки»;

— у баранов, больных бруцеллезом, в семенниках и придатках обнаруживают некротические или гнойные очаги различной величины; отмечают заполнение полости мошонки серозно-гнойным транссудатом, разрастание фиброзной ткани, сращение придатка с семенником и общей влагалищной оболочкой, иногда атрофию семенников.

1.3. Диагностика бруцеллеза включает лабораторные (бактериологическое, серологическое и молекулярно-генетическое) исследования материала и аллергическое исследование свиней в хозяйствах.

Плановые серологические исследования являются основным методом выявления больных и подозрительных по заболеванию животных.

Бактериологическую диагностику проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание. Одновременно проводят серологическое исследование сывороток крови этих животных.

Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) проводят в случае аборта и при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, из хозяйств, благополучных по данному заболеванию.

1.4. При взятии проб крови, молока и патологического материала, а также проведении лабораторных исследований необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.

2.1. Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности.

2.2. Для бактериологического исследования на бруцеллез направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от свиноматок берут не менее трех плодов) или селезенку, печень, желудок плода с содержимым, перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, и околоплодную жидкость.

Для прижизненной диагностики бруцеллеза от животных берут кровь, молоко, содержимое гигром (бурситов) и абсцессов. При диагностическом убое — дополнительно селезенку, печень, подчелюстные, заглоточные, предлопаточные, надколенные, подколенные, надвыменные, парааортальные, тазовые лимфатические узлы и половые органы. Жидкий материал берут в стерильную посуду (пробирки, банки).

При взятии содержимого гигром, бурс в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы (бурсы) и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в количестве 10 — 15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.

У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Молоко должно быть доставлено в лабораторию и исследовано в день взятия пробы. Если это невозможно, молоко консервируют сухой борной кислотой (0,1 г на 10 мл) или генцианвиолетом (0,4 мл 1%-ного спиртоводного раствора краски на 10 мл молока). Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 10 дней.

2.2.1. Отобранные для бактериологического исследования пробы упаковывают в целлофан или пергаментную бумагу, помещают в непроницаемую тару (ящик, банка, полиэтиленовый пакет) и в этот же день направляют в лабораторию. От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь (сыворотку крови) для серологического исследования на бруцеллез. Если в течение 24 — 30 ч взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в 4 — 5 раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.

2.3. Для серологического исследования в лабораторию направляют кровь (сыворотку крови) и молоко.

2.3.1. Кровь у животных берут из яремной вены (у свиней — из яремной, ушной или хвостовой; у собак — головной предплечья или латеральной подколенной голени; у лисиц и песцов — из бедренной вены; у норок — путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста в стерильные пробирки по 5 — 7 мл (от пушных зверей по 1 — 2 мл). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при 30 — 38 °С в течение 1 ч или при комнатной температуре 8 — 10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4 — 10 °С. Через 20 — 24 ч после взятия крови отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию в свежем или консервированном виде (сыворотку крови собак сливают через 3 — 4 ч и повторно через 10 — 12 ч).

Читайте также:  Акт эпизоотологического обследования хозяйства бруцеллез

Консервирование сывороток проводят:

— добавлением 0,05 мл (1 капля) 5%-ного раствора фенола на каждый миллилитр сыворотки при тщательном перемешивании;

— сухой борной кислотой (2 — 4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;

— путем однократного замораживания.

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут. со дня взятия крови при условии хранения их при 4 — 8 °С.

Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут.; замороженные сыворотки — в течение 3 сут. после однократного оттаивания.

Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.

2.3.2. Для исследования на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут сборную из каждой доли вымени одного удоя в одну стерильную пробирку в количестве 10 — 15 мл. При этом, если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и проч.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Молоко исследуют свежее (охлажденное до 4 — 10 °С или неохлажденное) или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10%-ного раствора формалина на 5 мл молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2 — 3 сут. Перед исследованием молоко необходимо тщательно перемешать для равномерного распределения сливок.

При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.

Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.

2.4. На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ установленной формы.

3.1. Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание.

3.2. Бруцеллы обнаруживают бактериоскопией мазков из патологического материала, выделением культуры бруцелл на питательных средах и, при необходимости, путем постановки биологической пробы на морских свинках.

3.3. Бактериоскопическое исследование

Из доставленного на исследование патологического материала делают по два мазка из каждого объекта. При исследовании абортированных плодов мазки готовят из содержимого желудка, жидкости брюшной и грудной полостей, печени, селезенки, а также котиледонов плодовых оболочек. Из паренхиматозных органов, котиледонов и другого плотного материала делают мазки-отпечатки, жидкий материал наносят на предметные стекла пипеткой.

Мазки, фиксированные над пламенем горелки, окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циль-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шину (см. Прил. N 1, п. 1). При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы — мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину в красный цвет.

3.4. Бактериологическое исследование

3.4.1. Для культивирования бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночный глюкозо-глицериновый бульон (ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), печеночный глюкозо-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар, эритрит-агар, сывороточно-декстрозный агар, печеночно-сывороточный агар и печеночно-аминопептидный агар, (см. Прил. N 1, п. 2) и другие питательные среды, предназначенные для этой цели.

3.4.2. Перед посевом материала кожу абортированного плода с поверхности по белой линии протирают тампонами, смоченными 5%-ным раствором фенола. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей набирают пастеровскими пипетками и высевают в 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром, а содержимое желудка — в 2 пробирки с бульоном и не менее 5 пробирок с агаром.

Из печени и селезенки вырезают кусочки размером не менее 2,0 х 1,5 х 2,5 см, увлажняют их спиртом, обжигают с поверхности и растирают в стерильной ступке с песком. Затем в ступку добавляют равное количество стерильного физиологического раствора и вновь растирают. Полученную взвесь пастеровской пипеткой по 0,1 — 0,2 мл высевают на поверхность предварительно подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается высев материала пастеровской пипеткой из органов (место прокола органа предварительно прижигают раскаленным шпателем). Из каждого органа делают посев на 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром.

Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем на 10 пробирок агара.

При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.

Из плодовых оболочек и плаценты вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений).

Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3%-ным раствором гидроокиси калия на 30 мин. Затем их обмывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала суспензию в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой на чашки со средой, содержащей бактериостатические препараты: генцианвиолет 1:200000 (0,1 мл 0,5%-ного спиртоводного раствора на 100 мл среды) или кристаллвиолет 1:100000, генцианвиолет и малахитовую зелень в концентрации каждой краски 1:200000, уксуснокислый натрий из расчета 12,5 мг на 100 мл среды и др.

Содержимое бурс, гигром высевают на 3 — 4 чашки с плотной питательной средой, содержащей бактериостатические препараты.

Пробы молока центрифугируют 30 мин. при 3000 об./мин. Верхний слой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0,1 — 0,2 мл вносят на 3 — 4 чашки с агаром, содержащим бактериостатические препараты. Молоко, консервированное генцианвиолетом или другими консервантами, высевают на среды без бактериостатических веществ.

3.4.3. Для выращивания культур посевы помещают в термостат при 37 — 38 °С.

При исследовании материала от крупного рогатого скота половину

засеянных пробирок и чашек культивируют в обычных условиях, другую

— в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (10 — 15%)

в СО -инкубаторе или эксикаторе (микроанаэростате). Аналогичные

условия можно создать в пробирках, закрытых резиновыми пробками

Перед парафинированием пробирки закрывают ватными пробками, пронося последние над пламенем горелки. Затем верхнюю часть пробки обрезают, а оставшуюся часть углубляют на 0,5 — 1,0 см внутрь пробирки и заливают расплавленным парафином.

Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:

— заполнения части объема углекислым газом из баллона или аппарата Киппа;

— внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25%-ного раствора кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л объема);

— сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора. Для определения концентрации углекислого газа в эксикаторе можно использовать химический метод (см. Прил. N 1, п. 3).

3.4.4. Посевы выдерживают в термостате при 37 — 38 °С в течение 30 сут. Первичный осмотр посевов проводят через 24 — 48 ч. Пробирки с агаром и бульоном, заросшие посторонней микрофлорой, обезвреживают путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.

В дальнейшем для обнаружения роста бруцелл посевы просматривают каждые 3 — 4 сут. визуально, при необходимости через лупу или малом увеличении микроскопа. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают посевным материалом.

При значительном росте посторонней микрофлоры (80% и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.

При просмотре посевов обращают внимание на характер роста микробов. На поверхности агара бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем свете — сероватый. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.

В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над уровнем бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.

При обнаружении роста на жидких средах и отсутствии характерного роста на агаре из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из специальных методов, и делают пересев на чашки с плотной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках культивируют так же, как и высевы из патологического материала.

Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним из специальных методов — по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на стекле с использованием набора компонентов для серологической дифференциации бруцелл.

Для постановки пластинчатой реакции агглютинации на стекле необходимы следующие компоненты: испытуемая культура, набор для серологической дифференциации бруцелл (выпускается биопредприятием), 0,5%-ный фенолизированный физиологический раствор рН 7,0 — 7,2.

Для исследования берут двухсуточные агаровые культуры. R- и S-сыворотки бруцеллезные агглютинирующие разводят 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором до рабочего разведения, указанного на этикетке коробки. Разведенные сыворотки допускается использовать в течение месяца. R-антиген бруцеллезный цветной для РА и антиген бруцеллезный для роз бенгал пробы в пластинчатой РА применяют неразведенными. Предметные стекла для реакции подготавливают общепринятым способом. Физиологический раствор, пробирки и пипетки должны быть стерильными.

Техника постановки реакции. На предметное стекло раздельно наносят по одной капле R- и S-сывороток бруцеллезных агглютинирующих и физиологического раствора. Испытуемую культуру бактериологической петлей отдельно эмульгируют в каплях R- и S-сывороток и в капле физиологического раствора для определения самоагглютинации культуры. Параллельно в каждом опыте ставят контроли: R- и S-сыворотки в разведении, указанном на этикетке, с цветным R-бруцеллезным антигеном и с роз бенгал антигеном.

Учет и оценка реакции. Реакцию учитывают невооруженным глазом или с помощью увеличительного стекла в течение 2 минут по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости с образованием четко выраженного агглютината — положительная реакция;

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости с выраженным агглютинатом — положительная реакция;

++ (2 креста) — неполное просветление жидкости со слабо выраженным агглютинатом — положительная реакция;

+ (1 крест) — жидкость без просветления с едва заметным агглютинатом — сомнительная реакция;

— (минус) — просветление жидкости не наступило, смесь гомогенная — отрицательная реакция.

Следует иметь ввиду, что реакция с R-бруцеллезной сывороткой проходит замедленно; агглютинат, как правило, мелкозернистый. Результаты реакции с испытуемой культурой считают достоверными, если в контролях R- и S- бруцеллезных сывороток с гомологичными антигенами агглютинация четко выражена не менее чем 3 креста, а с гетерологичными — отсутствует.

Реакцию с испытуемой культурой считают положительной при наличии агглютинации на 2 креста и более. При отрицательной реакции ее проводят повторно с этой же культурой, взятой из трех-четырех мест посева.

Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, культуральными и тинкториальными свойствами, а также дающие положительную реакцию агглютинации с R- и S- бруцеллезными сыворотками в отдельности или с обеими сыворотками одновременно при отсутствии самоагглютинации в физиологическом растворе, признают бруцеллами.

Культура возбудителя инфекционного эпидидимита баранов и бруцеллеза собак, вызванного B. canis, постоянно агглютинируется только R — бруцеллезной сывороткой.

3.5. Биологическое исследование

3.5.1. Биологическое исследование проводят на морских свинках (не менее двух) массой 350 — 400 г, предварительно проверенных на бруцеллез исследованием в РА сыворотки крови в разведении 1:5 с отрицательным результатом.

3.5.2. Для постановки биологической пробы используют тот же материал, что и для бактериологического исследования.

Из органов и содержимого желудка абортированного плода готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:10 и вводят морской свинке подкожно с внутренней стороны бедра в объеме 1 мл.

Из плаценты и плодовых оболочек, предварительно обработанных тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором, и подсушенных сухими стерильными тампонами, вырезают кусочки размером 0,5 х 0,5 см, фламбируют на пламени горелки, растирают в ступке со стерильным песком и заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят морской свинке в объеме 1 мл.

Содержимое гигром, бурс вводят морской свинке подкожно в объеме 0,2 — 0,3 мл. При этом необходимо учитывать возможность гибели животного от сопутствующей микрофлоры, особенно стрептококков.

Пробы молока центрифугируют 30 мин. при 3000 об./мин. Морской свинке вводят подкожно 2 — 3 мл материала из верхнего слоя (сливки) и осадка молока после центрифугирования.

3.5.3. На 15, 25 и 40-е сут. после заражения у морских свинок берут кровь в количестве 1 — 2 мл из ушной вены путем надреза или из сердца — путем пункции. Сыворотку крови исследуют в пробирочной РА в разведениях от 1:10 до 1:80.

При положительной реакции агглютинации в разведении 1:10 и выше морских свинок убивают. В случае необходимости получения культуры возбудителя материал от них исследуют бактериологически. Высевы делают пастеровскими пипетками в одну пробирку бульона и две пробирки агара из паховых, парааортальных лимфатических узлов (правых и левых), селезенки (2 высева), печени и костного мозга. Посевы культивируют, как описано в подпунктах 3.4.3 и 3.4.4.

При отрицательной РА у морских свинок в указанные выше сроки биопробу считают отрицательной, подопытных животных убивают, бакисследование не проводят.

3.5.4. При выделении культуры бруцелл на питательных средах из исходного материала биологическое исследование по данной экспертизе прекращают, а ранее зараженных морских свинок убивают без бакисследования.

3.6. Результат исследования на бруцеллез считают положительным при выделении культуры возбудителя или при получении у морской свинки положительной РА в разведении сыворотки крови 1:10 и выше, если из исходного материала культура не выделена.

При положительных результатах бактериоскопии и отрицательных результатах бактериологического исследования и биопробы материал считают подозрительным на бруцеллез. При сохранении патматериала или возможности взятия нового (кровь, молоко, моча и др.) исследование проводят методом полимеразной цепной реакции. По ее результатам делают заключение о заболевании животных бруцеллезом.

— бактериологического — до 1 мес.;

Читайте также:  Акт эпизоотологического обследования при бруцеллеза

3.8. В ветеринарных лабораториях все выделенные культуры бруцелл после их идентификации подлежат уничтожению путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.

3.9. При необходимости определения вида бруцелл выделенные от животных культуры направляют в республиканские, краевые, областные ветеринарные лаборатории или ветеринарные научно-исследовательские учреждения, в которых имеются лаборатории или отделы, занимающиеся изучением бруцеллеза животных и имеющие разрешение органов здравоохранения на работу с микроорганизмами второй группы.

4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических антител в сыворотке крови животных в реакции агглютинации (РА) в пробирках, реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК), реакции иммунодиффузии с 0-полисахаридным антигеном (РИД), пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба — РБП) и в молоке коров — кольцевой реакции (КР) и других реакциях, утвержденных в установленном порядке.

4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации (РА) в пробирках

4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, лошадей, верблюдов, оленей (маралов), собак, пушных зверей и морских свинок.

4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:

— испытуемые сыворотки крови (см. п. 2.3.1);

— позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием;

— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных из опыта или консервированная), изготовленная биопредприятием или полученная в лаборатории;

— антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Прил. N 2, п. 6);

— 0,5%-ный фенолизированный раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и антигена используют фенолизированный физиологический раствор хлорида натрия (0,85%-ный); при исследовании крови овец и коз — 5%-ный и оленей (маралов) — фенолизированный 10%-ный раствор хлорида натрия (см. Прил. N 2, п. 1).

4.2.3. Постановка реакции агглютинации

Реакцию агглютинации проводят в серологических пробирках в объеме 1 мл в четырех разведениях:

— при исследовании сывороток крови овец, коз, оленей (маралов) и собак — 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200;

— крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

— пушных зверей и морских свинок — 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.

Компоненты реакции вносят индивидуальными мерными пипетками (дозаторами) или групповыми дозаторами Флоринского.

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках первого ряда делают исходное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирку, добавляют к ней 2,4 мл соответствующего раствора хлорида натрия, смешивают и получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови овец, коз, оленей (маралов) и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5). Таким образом делают исходное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда штатива (по 10 проб в ряду).

После приготовления исходного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского или индивидуальных пипеток-дозаторов переносят в пробирки второго и третьего рядов по 0,5 мл исходного разведения сывороток (1:25; 1:12,5 или 1:5). В пробирках третьего ряда сыворотки смешивают, по 0,5 мл этого разведения переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда — в пятый. Из пробирок пятого ряда 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные разведения сывороток.

После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разведенного 1:10 соответствующим раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сыворотки в каждой пробирке удваивается и, в зависимости от вида исследуемых животных, будет составлять 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, они служат контролем качества сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.

При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей) или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл при исследовании сывороток овец, коз, оленей (маралов) и собак. Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена, разведенного соответствующим раствором хлорида натрия 1:20. При этом разведения сывороток будут соответственно 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят контроли с негативной и позитивной бруцеллезной сыворотками в таких же разведениях.

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при 37 — 38 °С на 16 — 20 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.

4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки до и затем, после легкого встряхивания, оценивают в крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости, микробные клетки антигена осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик» (75% агглютинации);

++ (2 креста) — неполное просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен (50% агглютинации);

+ (1 крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик» выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25% агглютинации);

— (минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» не наступило, на дне пробирки по центру образуется небольшой осадок микробов антигена в виде точки или пятна. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимается вверх в виде косички и равномерно распределяется в жидкости, которая при этом приобретает первоначальную мутность.

За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц (МЕ) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с титром 1:100 содержит 100 МЕ, 1:200 — 200 МЕ и т.д.).

Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности, соответствующие 75, 50, 25 и 0% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания пробирок из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по 0,5 мл физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50 и 25% просветления жидкости. В четвертой пробирке просветление отсутствует. Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.

При массовых исследованиях в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.

4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сывороткой крови крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), верблюдов и лошадей, не иммунизированных или иммунизированных неагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами (см. Прил. N 2, п. 7), содержащей 200 МЕ антител и выше; овец и коз — 100 МЕ и выше; оленей (маралов) и собак — 50 МЕ и выше; пушных зверей и морских свинок — 10 МЕ и выше.

При выявлении среди не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, а также иммунизированных неагглютиногенными вакцинами крупного рогатого скота, верблюдов и лошадей, животных, реагирующих только в РА с содержанием антител 50 — 100 МЕ, а среди овец, коз, оленей (маралов), собак — 25 МЕ, считают сомнительно реагирующими и исследуют повторно через 15 — 30 сут. При повышении титров заболевание считают установленным. При сохранении титров на прежнем уровне проводят дополнительные исследования по дифференциации, согласно утвержденным методам.

При выявлении в стадах крупного рогатого скота, ранее иммунизированного против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами (см. Прил. N 2, п. 7), животных, реагирующих только в РА с содержанием не выше 200 МЕ антител и РСК в разведении сыворотки крови не выше 1:10, их повторно исследуют через 15 — 30 сут. в РА, РСК и РИД. При повышении содержания антител в исследуемых сыворотках в РА и (или) РСК или положительной РИД заболевание считают установленным.

При выявлении в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота, ранее не иммунизированных или иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, животных, положительно реагирующих в РА с содержанием 100 МЕ антител и выше, признают больными. Реакцию считают сомнительной при содержании 50 МЕ антител. Сыворотки крови от таких животных через 15 — 30 сут. исследуют повторно. При получении вновь сомнительного результата животных признают больными бруцеллезом.

При исследовании в РА неиммунизированных баранов-производителей, козлов, пробников и ярок, содержащихся в благополучных по бруцеллезу отарах, где овцы (козы) иммунизированы против бруцеллеза, реакцию считают положительной, а заболевание установленным при содержании в сыворотке крови животных 100 МЕ антител и выше. Реакцию считают сомнительной при наличии 50 МЕ антител. Сыворотки крови от таких животных через 15 — 30 сут. исследуют повторно. При получении вновь сомнительных результатов животных признают здоровыми, а отару — благополучной по бруцеллезу.

В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженный в международных единицах (например: титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:200 с оценкой 2 — 4 креста — «положительная» 200 МЕ; титр сыворотки 1:100 с оценкой 2 — 4 креста — «сомнительная» 100 МЕ).

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его годности, а также титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических исследований.

4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК)

4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов), собак и пушных зверей.

Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо РСК при исследовании на бруцеллез сывороток крови животных.

4.3.2. Компоненты реакции и их подготовка к работе:

— испытуемые сыворотки крови (см. п. 2.3.1);

— позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от больного бруцеллезом животного;

— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных из опыта или консервированная), изготовленная на биопредприятии или полученная в лаборатории.

Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной бане в день постановки реакции: для РСК — при 60 — 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов и мулов — 64 — 65, буйволов — 62 — 64, свиней — 58 — 60 °С); для РДСК — сыворотки крови животных всех видов — при 63 — 64 °С в течение 30 мин.;

— антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК в рабочем титре, указанном биопредприятием-изготовителем (см. Прил. N 2, п. 6);

— комплемент — сыворотка крови морской свинки, лиофильно высушенная, биофабричного изготовления или нативная (свежая или консервированная добавлением 2 — 4% борной кислоты).

Сухой биофабричный комплемент растворяют физиологическим раствором, как указано на этикетке коробки. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для проведения всего опыта количество комплемента. В каждую ампулу (флакон) вносят физиологический раствор и, не встряхивая, помещают в холодильник на 20 — 30 мин. Растворившийся комплемент осторожно перемешивают путем легкого встряхивания ампул (флаконов), сливают в одну пробирку, смешивают и помещают в холодильник при 4 — 10 °С. Непосредственно перед внесением в пробирки для титрования растворенный или нативный комплемент разводят физиологическим раствором 1:20, а остальной — хранят в холодильнике для постановки главного опыта. Рабочее разведение комплемента также готовят непосредственно перед внесением в пробирки главного опыта;

— гемолитическая сыворотка (гемолизин) — сыворотка крови кролика, гипериммунизированного эритроцитами барана, — для РСК и РДСК в удвоенном титре. Титрование гемолизина проводят при использовании каждой новой серии и по истечении срока годности (см. Прил. N 2, п. 5);

— эритроциты барана — 2,5%-ная от осадка взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе для РСК и РДСК (см. Прил. N 2, п. 3).

Для приготовления гемолитической системы взвесь эритроцитов и раствор гемолизина в рабочем разведении смешивают в равных объемах и при постановке РСК выдерживают в водяной бане при 37 — 38 °С в течение 15 — 20 мин. при периодическом перемешивании, а при постановке РДСК — в холодильнике. При смешивании компонентов раствор гемолизина вливают во взвесь эритроцитов;

— физиологический раствор — 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде с рН 6,8 — 7,2 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и кальция (см. Прил. N 2, п. 2). Последний в обязательном порядке готовят в случае использования нативного комплемента (свежей или консервированной сыворотки крови морской свинки).

Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции и при необходимости проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:

источник